靶向胶质瘤干细胞的免疫治疗

　　靶向胶质瘤干细胞的免疫治疗，目前一直在探寻疗效确切的胶质瘤免疫治疗方案，主要包括被动免疫治疗、过继免疫治疗和主动免疫治疗。被动免疫治疗是利用抗体或毒素等免疫效应分子，在不直接激活免疫系统的情况下靶向杀伤肿瘤细胞；过继免疫治疗是通过过继性T细胞转移和应用嵌合抗原受体T细胞（CAR-T），在体外以肿瘤抗原激活T细胞，然后再将这种可特异性识别肿瘤的活化T细胞输入患者体内，达到免疫治疗目的。主动免疫治疗通常称为疫苗接种，通过各种来源的肿瘤相关抗原（TAA），如肿瘤裂解物、肿瘤细胞、mRNA或多肽，直接激活患者免疫系统，实现抗肿瘤之目的。

　　1）靶向胶质瘤干细胞的单克隆抗体

　　由单克隆抗体介导的靶向肿瘤抗原的免疫治疗已逾30年，由于单克隆抗体的直接细胞杀伤和免疫调节作用而在肿瘤免疫治疗中曾占据重要地位，随着各种胶质瘤干细胞标志物陆续得到鉴定，各类人源化小分子多功能单克隆抗体被寄予厚望。表皮生长因子受体（EGFR）基因扩增和突变是胶质瘤干细胞的重要遗传学特征，直接靶向EGFR的单克隆抗体已用于胶质瘤的治疗，其中研究较多、应用较广泛的是西妥昔单抗，通过干扰配体结合和EGFR细胞外二聚体形成，阻断EGFR介导的信号转导通路而发挥功能。

　　转化生长因子-β（TGF-β）信号转导通路参与胶质瘤发生和恶性进展的多个环节，恶性胶质瘤患者血清TGF-β表达变化与肿瘤分级和预后呈正相关，TGF-β信号转导通路主要通过调控干细胞相关基因如SOX4、SOX2、LIF，实现胶质瘤干细胞的自我更新并控制其分化。

　　临床研究显示，靶向TGF-β的免疫治疗无明显不良反应，复发胶质瘤患者的肿瘤细胞可被抗TGF-β抗体GC1008靶向结合，并在治疗早期即显示出良好的肿瘤控制作用，但并不能阻止治疗后期临床和影像学出现的肿瘤进展，故而未能实现长期临床获益。贝伐单抗是另一用于治疗胶质瘤的单克隆抗体，是美国食品与药品管理局（FDA）批准用于治疗高级别胶质瘤的人源血管内皮生成因子（VEGF）单克隆抗体，具有的抗肿瘤血管生成作用，且可干扰胶质瘤干细胞小生境中的血管状态，导致胶质瘤干细胞易受其他治疗方法的损伤，但在多项临床试验中并未观察到明显的生存获益，仅可在时间内控制瘤周水肿以好转临床症状，以及在放射治疗所致假性进展方面有确切疗效。

　　2）靶向胶质瘤干细胞的溶瘤病毒

　　溶瘤病毒（OVs）是经过设计的具有选择性在肿瘤细胞中繁殖并杀伤肿瘤细胞的治疗药物。其重要设计原则是减弱或删除病毒毒力因子，使溶瘤病毒无法在正常组织中复制，但仍保留在肿瘤细胞内复制并杀伤肿瘤细胞的能力。目前已证实肿瘤特异性基因，如RAS、TP53、RB1、同源性磷酸酶-张力蛋白（PTEN）和Wnt信号转导通路中的编码基因及其他肿瘤相关基因，可增加肿瘤细胞对病毒的易感性，这是由于促肿瘤与抗病毒的信号转导通路之间形成干扰，从而为病毒复制提供适宜的环境。

　　此外，哺乳动物细胞抗病毒过程中的关键环节是由干扰素（IFN）介导的，而肿瘤细胞中IFN信号转导通路缺陷，不具有较强的抗病毒能力。肿瘤干细胞同样具有肿瘤特异性基因突变和IFN信号转导通路缺陷的特点，故溶瘤病毒可以合适杀伤肿瘤干细胞，该疗法已在荷瘤小鼠体内显示出的抗肿瘤疗效。动物实验显示，携带白细胞介素-12（IL-12）的溶瘤性单纯疱疹病毒（HSV）可使荷瘤小鼠脑肿瘤消退。

　　溶瘤病毒治疗胶质瘤进展较快，由于胶质瘤干细胞高度富集整合素如αvβ3或αvβ5，通过基因工程技术设计的溶瘤病毒可以通过这些整合素进入胶质瘤干细胞而发挥抗肿瘤作用，其中DNX-2401是一种具有肿瘤特异性和强感染能力的溶瘤病毒，已用于Ⅰ期临床试验且顺利性良好、肿瘤体积明显缩小、患者生存期延长。

　　除直接的溶瘤作用外，趋化性增强的免疫细胞和细胞毒性T细胞也参与抗肿瘤过程，从而产生明显的临床疗效。除脑胶质瘤外，溶瘤病毒对多种体部恶性肿瘤的肿瘤干细胞亦具有杀伤效应。

　　在乳腺癌模型中，溶瘤病毒GLV-1h68可在肿瘤干细胞内选择性复制并杀伤高表达乙醛脱氢酶1（ALDH1）的肿瘤干细胞；在卵巢癌模型中，拮抗趋化因子受体4（CXCR4）的溶瘤病毒对CD44+CD117+肿瘤干细胞具有明显杀伤作用；在结肠癌模型中，靶向肿瘤干细胞标志物CD133的溶瘤腺病毒可以选择性感染CD133+肿瘤干细胞，溶瘤病毒与氟尿嘧啶（5-FU）联合应用对CD133+和CD44+肿瘤干细胞具有明显治疗效果；在肝癌模型中，溶瘤性麻疹病毒可靶向并裂解CD133+肿瘤干细胞。此外，溶瘤病毒还具有调节荷瘤宿主机体免疫力的作用，使免疫系统可以更好地适应病毒抗肿瘤活性。

　　3）靶向胶质瘤干细胞的嵌合抗原受体T细胞

　　过继性T细胞治疗（ACT）是一种个性化治疗，这种免疫细胞具有直接抗肿瘤活性。过继性T细胞治疗需首先从患者体内分离出浸润肿瘤的T细胞，在IL-2的刺激下，经体外培养使其具备特异性识别肿瘤的能力，然后再将其回输至患者体内。与通过肿瘤相关抗原刺激固有免疫系统的主动免疫不同，过继转移的CAR-T细胞可以直接靶向肿瘤相关抗原而不依赖抗原提呈过程。嵌合抗原受体（CAR）可以靶向肿瘤表面抗原并激活T细胞，从而达到抗肿瘤作用。相对于体内固有的数目少且功能低下的肿瘤特异性T细胞，CAR-T细胞可以在体外扩增至较高水平，从而诱导较强的细胞毒性免疫反应。

　　CAR-T细胞目前已成功用于血液系统恶性肿瘤的治疗，由于实体肿瘤表面缺乏特异性抗原，该疗法在实体肿瘤中的应用尚待深入探索。晚近靶向肿瘤干细胞的CAR-T细胞疗法，已在各种类型肿瘤模型中进行观察研究，以评价其抗肿瘤活性：在腺癌模型中，针对EpCAM抗原的CAR-T细胞可以根除PC3M和PC3肿瘤模型中的肿瘤干细胞；膜嵌合IL-15构建的CAR-T细胞在CD19+白血病中可诱导生成靶向肿瘤干细胞的记忆性T细胞；在结肠癌模型中，过继转移的CD8+细胞毒性T细胞可特异性识别肿瘤干细胞抗原ASB4，进而选择性消灭肿瘤干细胞。

　　但是考虑到CAR-T细胞疗法对中枢神经系统的不良反应，如认知功能障碍、脑积水等，其治疗胶质瘤的报道尚不多见。胶质母细胞瘤和胶质瘤干细胞中较常见的EGFR基因特异性突变——表皮生长因子受体变异体Ⅲ（EGFRvⅢ）目前已成为CAR-T细胞疗法的重要靶点。靶向EGFRvⅢ的CAR-T细胞疗法在荷瘤小鼠模型以及Ⅰ期临床试验（试验编号：NCT02209376）中可清除表达EGFRvⅢ的肿瘤细胞，经逆转录载体转导，可使CAR-T细胞表达特异性IL-13Rα2或人表皮生长因子受体2（HER2），进而靶向杀伤胶质瘤干细胞；由于CD133+胶质瘤干细胞高表达IL-13Rα2和HER2，故可被CAR-T细胞识别并杀伤。上述研究表明，胶质瘤干细胞可能成为CAR-T细胞疗法的潜在靶点。

　　4）靶向胶质瘤干细胞的肿瘤疫苗

　　肿瘤疫苗可以激活宿主免疫系统，识别并杀伤肿瘤细胞，属主动免疫治疗。激活免疫系统的较佳途径是刺激多功能抗原呈递细胞（APC），如树突状细胞（DC）、巨噬细胞、B淋巴细胞（以下简称B细胞），其中以树突状细胞为较佳选择。树突状细胞自外周血单个核细胞（PBMC）中分离纯化，先由IL-4和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）刺激生成未成熟的树突状细胞，再以IL-1b、IL-6、腺素E2（PGE2）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）混合物成分刺激，获得成熟的树突状细胞。

　　树突状细胞疫苗治疗肿瘤的主要目的是产生特异性辅助性T细胞（Th），从而激活细胞毒性T细胞的抗肿瘤作用。肿瘤细胞中可被树突状细胞识别的各种成分称为肿瘤相关抗原，激活的树突状细胞回输至患者体内后，通过向肿瘤特异性T细胞提呈肿瘤相关抗原以增强抗肿瘤免疫反应。

　　恶性实体肿瘤动物模型的观察结果业已显示，靶向肿瘤干细胞相关抗原的树突状细胞疫苗具有明确的疗效：在恶性黑色素瘤模型中，由肿瘤干细胞裂解物致敏的树突状细胞可使荷瘤小鼠分泌更多的INF-γ和IL-4，控制肿瘤生长并延长小鼠存活期；在卵巢癌模型中，包含NANOG肽的树突状细胞可以识别肿瘤干细胞并诱导高度特异性抗肿瘤T细胞免疫反应；有研究显示，树突状细胞可通过共同提呈肿瘤特异性抗原和Toll样受体（TLR）激活宿主对黑色素瘤的免疫反应，肿瘤细胞崩解后部分成分又可增强树突状细胞对主动免疫的刺激；临床研究显示，胶质瘤患者术后接受树突状细胞疫苗治疗顺利、合适。

　　由此可见，肿瘤疫苗通过将肿瘤相关抗原更多地暴露给免疫细胞，激活免疫系统，产生抗肿瘤作用，因此，能否制备出合适识别肿瘤干细胞并激活免疫反应的树突状细胞疫苗是提高免疫治疗效果的关键。Jachetti等的研究显示，与经分化肿瘤细胞致敏的树突状细胞相比，以耐受放射治疗的肿瘤干细胞致敏的树突状细胞可促使机体产生更强的T细胞毒性并分泌更多的IFN-γ。

　　Dashti等分别通过小鼠黑色素瘤细胞系B16F10和肿瘤干细胞裂解物致敏树突状细胞，发现经后者致敏的树突状细胞可明显延长荷瘤小鼠存活期。Ning等发现，通过肿瘤干细胞裂解物致敏的树突状细胞可使接受免疫治疗的荷瘤小鼠产生较高水平的IgG，从而在补体存在的情况下增强其细胞毒性；此外，在黑色素瘤和鳞状细胞癌模型中，通过肿瘤干细胞致敏的树突状细胞可以使荷瘤小鼠体内产生更强的细胞毒性作用。

　　胶质瘤干细胞具有相同的树突状细胞致敏能力，因此直接靶向这一肿瘤细胞亚群，进而建立针对胶质瘤的肿瘤疫苗有望成为合适的治疗方案。临床试验显示，胶质母细胞瘤患者通过移植转染自体胶质瘤干细胞mRNA的树突状细胞，激发适应性免疫反应，使肿瘤消退，延长总生存期（OS）。Finocchiaro和Pellegatta经对一系列临床前研究结果的总结，得出以富含胶质瘤干细胞的细胞群致敏树突状细胞可以增强胶质瘤免疫治疗效果的结论，进而提出胶质瘤干细胞高表达的FABP7、GLAST、CD133、SOX2等是肿瘤疫苗免疫治疗的良好靶点，有利于提高胶质瘤患者整体生存率。

　　制备胶质瘤干细胞肿瘤疫苗，需先将手术切除的肿瘤标本制备为单细胞悬液，然后在干细胞培养条件下分离单个胶质瘤干细胞并增殖为干细胞球，再提取胶质瘤干细胞mRNA并转染至单个核细胞来源的树突状细胞。ICT-107疫苗是由6种合成多肽致敏自体外周血单个核细胞分化的树突状细胞，可靶向胶质瘤干细胞相关抗原，例如HER2、黑色素瘤缺乏因子2（AIM2）、gp100、IL-13Rα2、酪氨酸相关蛋白-2（TRP-2）、黑色素瘤抗原基因-1（MAGE1）等。

　　Phuphanich等在针对新发胶质母细胞瘤的标准治疗方案中增加了ICT-107疫苗治疗，结果显示，患者中位无进展生存期（PFS）为16.9个月、中位总生存期为38.4个月，部分患者接种该疫苗后经历再次手术切除，切除标本中胶质瘤干细胞数目明显减少，提示该疫苗可以诱导机体抗肿瘤免疫靶向杀伤胶质瘤干细胞。

　　Wen等的Ⅱ期临床试验是针对胶质瘤干细胞并获得阳性结果的免疫治疗的随机对照试验，观察新发胶质母细胞瘤患者手术和放化疗后加用树突状细胞疫苗对患者无进展生存期或总生存期的影响，其结果显示，ICT-107组患者中位无进展生存期延长2个月且差异具有统计学意义，总生存期也有所延长但未达到统计学意义。

　　VikMo等研究发现，胶质瘤患者接受规范化综合治疗后于皮下注射胶质瘤干细胞疫苗，可成功诱导出增强的抗肿瘤免疫反应（7/10例）；接种疫苗的患者无进展生存期较对照者延长2.9倍且无严重不良反应。在生理状态下，中枢神经系统在主动免疫治疗过程中激活的树突状细胞较少，需补充造血干/祖细胞以提供树突状细胞并持续诱导合适的T细胞反应，造血干/祖细胞进入中枢神经系统后分化为CD86+CD11c+MHCⅡ+细胞，呈现出活化树突状细胞表型和功能，从而激发细胞毒性免疫反应。造血干/祖细胞来源的细胞因高表达CD86等共刺激分子而表现出较强的抗肿瘤免疫作用。

　　近年来，SOX2作为一种维持胶质瘤干细胞的重要转录因子，被认为是主动免疫治疗的新靶点，SOX2肽疫苗可以增强全身和局部免疫反应，并在肿瘤模型中延长荷瘤动物存活期，无论是否联合化疗均可观察到确切的疗效。因此，靶向SOX2等胶质瘤干细胞相关基因的疫苗可以为主动免疫治疗提供新的方案。

　　5）针对胶质瘤干细胞的自然杀伤细胞

　　以自然杀伤（NK）细胞为基础的过继免疫治疗无论对血液系统肿瘤还是实体肿瘤均是一种有前景的免疫治疗策略。NK细胞抗肿瘤的基础依赖NK细胞及其活化性受体［如NK细胞活化性受体NKG2D、DNAX辅助分子1（DNAM-1）等］对肿瘤细胞表达的对应配体［如主要组织相容性复合物Ⅰ类链相关分子A和B（MICA和MICB）、人类巨细胞病毒糖蛋白UL-16结合蛋白（ULBP）、脊髓灰质炎病毒受体（PVR）、黏连蛋白2等］的识别，识别并激活后的NK细胞产生细胞毒性，进而杀伤肿瘤细胞。正常细胞可表达较高水平的被NK细胞控制性受体识别的主要组织相容性复合物Ⅰ（MHCⅠ）类分子，从而免受NK细胞的攻击。

　　体外研究显示，胶质瘤干细胞可表达高水平的PVR和黏连蛋白2，NK细胞活化性受体DNAM-1可以特异性识别上述两种配体，进而杀伤胶质瘤干细胞。大多数恶性肿瘤的肿瘤干细胞MHCⅠ类分子表达水平较低，刺激NK细胞控制性受体的作用较弱，从另一方面活化NK细胞多条信号转导通路参与肿瘤干细胞中NK细胞配体的调节，其中MICA、MICB和ULBP在肿瘤上皮间质转化（EMT）过程中上调，RAS/PI3K信号转导通路激活可促进NKG2D对应的配体在胶质瘤干细胞中的表达。

　　NK细胞可对病毒感染和肿瘤形成产生快速反应，在活化性受体阳性且控制性受体阴性的情况下，NK细胞可直接裂解MHCⅠ缺失的肿瘤细胞或其他病原体。有多项研究支持肿瘤干细胞是NK细胞免疫杀伤作用的易感靶点：Tseng等的研究显示，与分化肿瘤细胞相比，NK细胞与口腔鳞癌干细胞、人胚胎干细胞、间充质干细胞、牙髓干细胞和人诱导型多能干细胞（iPSCs）进行共同孵育时，NK细胞毒性增强，IFN-γ分泌增加；Castriconi等发现，源于胶质母细胞瘤的胶质瘤干细胞对经IL-2或IL-15激活的NK细胞介导的裂解物高度敏感；新鲜纯化的同种异体NK细胞可识别并杀伤结直肠癌来源的肿瘤干细胞，而分化的肿瘤细胞对NK细胞的敏感性较低，这种NK细胞对肿瘤干细胞和普通肿瘤细胞易感性的差异与肿瘤干细胞表面活化性受体对应配体的表达水平相关，肿瘤干细胞中特异性结合激活性受体NKp30和NKp44的配体表达水平明显高于非肿瘤干细胞。

　　上述研究表明，NK细胞过继免疫治疗有可能在根除残留肿瘤干细胞方面发挥作用，NK细胞除直接杀伤肿瘤干细胞外，还可诱导其分化。在肿瘤干细胞和IL-2同时存在的情况下，CD16可控制NK细胞毒性并促进其细胞因子分泌，NK细胞这种状态称为“分裂无力”。NK细胞可分泌大量IFN-γ，诱导肿瘤干细胞中的MHCⅠ、分化受体和细胞程序性死亡蛋白配体1（PDL1）表达水平升高，并降低肿瘤干细胞标志物CD44表达水平，这种诱导分化肿瘤干细胞的作用可使肿瘤细胞的生长和转移受到控制。由此可见，NK细胞通过两步机制控制肿瘤进展，先杀伤一部分肿瘤干细胞，然后在NK细胞分裂停滞的状态下，诱导剩余肿瘤干细胞群体细胞分化。