液体活检在胶质瘤诊断中的意义——术中超声在脑胶质瘤手术中的应用

　　脑胶质瘤是较常见的中枢神经系统原发性恶性肿瘤，大约每100000人有7.3例，其中高级别胶质瘤约占85%，低级别别胶质瘤约15%，多见于成人。神经胶质瘤细胞可来源于不同的前驱细胞，即少突细胞(oligodendrocyteprecursorcells)OPCs是一种重要的原始细胞，在p53和NF1基因敲除之后，OPCs大部分时间都保持稳定，而成人的OPCs将被重新激活，增生直到恶变。

　　类雷帕霉素靶蛋白信号通路与胶质瘤的发生发展密切相关。因其发病机制复杂，多数神经胶质瘤不易早期发现，诊断神经胶质瘤仍面临较大挑战。常规诊断方法主要包括病理组织活检和颅脑影像学，但二者都存在局限性：前者作为侵袭性手段，对病人的依从性不强；后一种鉴别诊断仍有困难，因而延误较佳治疗时间。

　　当前，科学家们对于肿瘤的临床检测，对于无创诊断技术，也就是液体活检，表现出较大的兴趣。通过分离检测来自体液的循环肿瘤细胞，肿瘤DNA小分子RNA、外泌体等为肿瘤的临床决策提供了丰富的信息，其应用可以弥补传统诊断方法的不足。该文重点介绍神经胶质瘤的液体活检技术和新的肿瘤标志物，并探讨其临床应用前景。

　　1.CTCs。

　　在原发性肿瘤中，胶质瘤细胞和胶质瘤干细胞通过激活诸如胞外粘附分子等信号途径(gliomastemcells)，CTCs可进入血管形成CTCs，由于CTCs具有干细胞的特性，在放化疗和循环应激诱发的细胞凋亡方面也有的耐受性。GSCs的重要抗原相关因子过表达影响DNA的复制和嘧啶代谢途径，PAF与增殖细胞核抗原PCNA是相互影响和调节DNA跨损伤修复的，这样，GSCs就具有很强的自我更新能力，引起胶质母细胞瘤患者对放射治疗不敏感，具有相似PAF效果的还有Akt家族基因和磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(proteinkinaseB,Akt)信号通路。

　　CTCs簇在Krol等一次确认了胶质母细胞瘤中存在。用glialfibrillaryacidicprotein,Müller等利用胶质细胞原纤维酸性蛋白进行分析和筛选，以GFAP为标志，通过比较基因组杂交技术，荧光原位杂交，本研究进一步证实CTCs来源于GBM，但本研究采用GFAP免疫染色法，外周血中只有20.6%的GBM患者有CTCs。

　　同时，原位杂交也能检测到CTCs的miRNAs,Ortega等在上皮来源循环瘤细胞中检测miRNA-21。所以，使用该技术可以使脑胶质瘤得到早期诊断。但因CTCs获得率低、纯度低、所得到的CTCs与原肿瘤细胞间异质性等问题尚需进一步探讨，以推广到临床。为减少脑胶质瘤背景噪声，提高其诊断技术的特异性，已有科学家试图将CTCs从脑脊液中分离出来，希望能从中获得肿瘤细胞。

　　2.ctDNA。

　　一种DNA被称为血浆DNA(cell-freeDNA,cfDNA)，这种DNA是一种来自肿瘤细胞的DNA。采用无创的ctDNA获得方法，有利于GBM的诊断和分型，有助于制定治疗方案，检测病人对治疗的反应。对于获得的ctDNA，可以进行微滴数位PCR(dropletdigitalPCR,ddPCR)定量分析，突变基因检测，基因组，表观基因组和蛋白质组分析等。

　　一项研究显示，19位脑脊液中分离出ctDNA的病人中，只有3位cfDNA检测到35个突变位点，包括1p/19q共缺失。cfDNA突变型IDH1/IDH2及生长因子受体信号途径等，cfDNA突变位点的平均变异等位基因分数明显低于脑脊液来源的ctDNA(0.58%vs23.96%)，脑脊液中也发现大部分克隆突变在肿瘤组织中存在。通过对肿瘤DNA的联合检测，发现更多的特异突变位点，可使肿瘤DNA诊断胶质瘤的特异性达到全切。

　　虽然如此，不同体液来源的DNA方法学特征和所提供的信息仍存在差异，脑脊液来源的ctDNA提供的信息更为准确，与cfDNA相比，cfDNA来源的ctDNA突变位点的检测灵敏度更高(全切vs38%)，其优点在于改进了检测分析方法，使体复制数变化即将成为现实(somaticcopynumberalteration)利用sWGS数据，结合配对端测序确定的DNA片段模式，SCNAs)结合分析法检测CSF中肿瘤细胞的游离DNA(cell-freetumorDNA，cftDNA)同时结合特异片段基因测序和DNA分子片段长度测定，可以进一步提高神经胶质瘤检测技术的准确度，被试操作特征曲线下面积(areaundercurve,AUC)由小于0.5增加到大于0.91。

　　考虑到脑脊髓液中ctDNA的密度低于周围血，Mair等发现了循环肿瘤的线粒体DNA可代替核ctDNA，还可在脑脊液和尿液中检出胶质母细胞瘤，所以tmtDNA具有更广泛的用途。

　　miRNA

　　miRNA是一种非编码RNA，长度约22nt，广泛分布在从病毒到人类的多种生物中，通过与mRNA的3'-UTRs结合来控制mRNA表达，阻止蛋白质合成。多项研究表明miRNA在人类疾病发生过程中起着重要作用，比如神经胶质瘤。因为恶性细胞是异质性的，ctDNA不会有完全相同的序列，而miRNAs则比较一致。

　　Zhou等通过meta分析发现，miRNAs的总体检测灵敏度可达85%(95%CI:0.81~0.89)，特异度90%(95%CI:0.85~0.93),AUC为93%(95%CI:0.91~0.95)，84%(95%CI:0.80~0.88)、85%(95%CI:0.81~0.89)和92%(95%CI:0.89~0.94)，89%(CI:0.73-0.96)、大概率(95%CI:0.73~0.96)、大概率(95%CI:0.96~0.99);mi同时检测。