【INC国际大咖研究成果】颅内动脉瘤为什么会破裂？研究发现：缺氧微环境是幕后推手

　　高血压是颅内动脉瘤形成以及破裂公认的危险因素。高血压导致头部血流动力学改变，特别是增加了颅内动脉分叉处动脉壁的剪切力，造成血管壁张力增加，引起动脉壁结构改变和功能障碍，血管活性物质失衡，管壁损伤，促使动脉瘤形成和发展，当这个机械冲击力达到一定阈值，超过了动脉瘤壁的承受压力，最终导致动脉瘤破裂出血。这是外部因素，动脉瘤破裂的内部原因究竟是什么？

　　以颅内动脉瘤破裂为主要原因的蛛网膜下腔出血，尽管现代技术不断进步，其预后仍然相当差。因此，应阐明病变破裂的潜在机制。INC国际脑血管搭桥手术大咖川岛明次（Akitsugu Kawashima）教授和其他研究者阐明了颅内动脉瘤病变中滋养血管的形成，推测其为炎症细胞浸润病变提供了途径，是导致破裂的潜在组织病理学改变。在该研究中，他们利用组织透明化技术和三维免疫组织化学，明确了滋养血管起源于脑表面的动脉。通过使用缺氧探针，他们随后发现缺氧微环境主要存在于形成动脉瘤的颅内动脉外膜。此外，他们确定了在这种缺氧条件下培养的巨噬细胞中血管内皮生长因子的产生。进一步地，他们在大鼠模型中诱导的易破裂动脉瘤病变和人类未破裂动脉瘤病变中都发现了血管内皮生长因子的积聚。最后，他们证实了血管内皮生长因子依赖性新生血管从脑表面动脉的诱导。本研究的发现揭示了缺氧微环境和缺氧诱导的血管内皮生长因子产生作为触发动脉瘤破裂的机制，通过为病变中的炎症细胞提供通道以加剧炎症反应的潜在作用。

　　图示：颅内动脉壁外膜中缺氧微环境的存在。 给大鼠腹腔注射缺氧探针（60 mg/kg），即哌莫硝唑的衍生物，以标记缺氧细胞或组织，并使用特异性抗体通过免疫组织化学检测颅内动脉壁中该探针的存在。图中显示了颅内动脉壁（A）、作为阳性对照的肝脏（B）或主动脉（C）的缺氧探针免疫荧光染色图像[（A、C）中为红色，（B）中为绿色]、DAPI核染色图像（蓝色）以及合并图像。不使用一抗的免疫组织化学图像或未给予缺氧探针的标本图像作为阴性对照。比例尺：50 μm。

　　川岛明次教授研究结果

　　巨噬细胞在缺氧下分泌VEGF

　　诱导滋养血管形成

　　滋养血管起源为脑表面动脉的鉴定。 由于颅内动脉在组织学上缺乏滋养血管，我们通过结合组织透明化的免疫组织化学技术来可视化血管平滑肌细胞，从而研究了滋养血管的来源。在破裂的动脉瘤壁上，位于脑表面的动脉朝向动脉瘤穹窿部走行，特别是在破裂部位周围，血管平滑肌细胞标志物α-平滑肌肌动蛋白的信号缺失。在切片中也证实了动脉瘤破裂部位周围存在带有中层平滑肌细胞的滋养血管。

　　颅内动脉外膜缺氧微环境的存在。 我们首先假设颅内动脉的外膜处于缺氧条件下，因为其缺乏滋养血管且脑脊液中氧分压低。为了评估这一假设，将缺氧探针（哌莫硝唑的衍生物，可与缺氧细胞结合）给予大鼠，然后使用特异性抗体进行免疫组织化学检测，以检查该探针在颅内动脉壁中的存在，同时使用肝脏作为阳性对照，或使用主动脉。结果，在颅内动脉壁外膜处的细胞中观察到缺氧探针的信号，而在肝脏中央静脉周围的细胞中观察到信号作为阳性对照，支持了上述假设。有趣的是，在存在滋养血管的主动脉中只能稀疏地观察到缺氧探针的阳性信号，表明了颅内动脉壁的独特性。

　　缺氧条件下培养的巨噬细胞或成纤维细胞中VEGF及其他血管生成因子的诱导。 由于颅内动脉在组织学上缺乏滋养血管，颅内动脉的外膜处于缺氧微环境中，氧分压约为40 mmHg，相当于5%氧气。因此，我们首先检测了外膜生理性缺氧条件对培养的巨噬细胞RAW264.7中主要血管生成因子VEGF表达的影响。然后我们发现，外膜生理水平的缺氧诱导了RAW264.7细胞中Vegf的表达。接下来，我们将细胞置于更低的氧分压下，即病理性缺氧，这可能出现在病变的炎症微环境中，那里聚集了许多炎症细胞并激活了多种类型的细胞。这种病理性缺氧条件不仅在培养的巨噬细胞RAW264.7中，而且在培养的成纤维细胞NIH3T3中也诱导了Vegf的表达。在培养的成纤维细胞中，可能产生了缺乏外显子6的VEGF选择性剪接形式。ELISA也证实了缺氧处理的RAW264.7细胞分泌VEGF蛋白。还检测了缺氧刺激的RAW264.7细胞中除Vegf以外的血管生成相关因子的表达。在缺氧条件下，只有少数因子被诱导，表明VEGF在缺氧条件下的巨噬细胞中发挥核心作用。此外，施加于细胞的缺氧诱导了多种类型细胞中一些促炎基因的表达，包括Ptgs2或Ccl2。COX-2的诱导可能通过形成正反馈环路加剧炎症，而CCL2的分泌形成了巨噬细胞的自身放大环路，表明局部慢性炎症的进一步放大。

　　大鼠诱导的动脉瘤壁中VEGF的表达。 我们接下来通过免疫组织化学检测了VEGF是否确实在易破裂的动脉瘤中表达，在这些动脉瘤中诱导了滋养血管。然后在免疫组织化学中检测到动脉瘤病变中的VEGF信号。由于大多数VEGF信号与巨噬细胞标志物CD68的信号很好地共定位，因此易破裂动脉瘤病变中产生VEGF的主要来源是浸润病变的巨噬细胞。上述体外实验支持了浸润巨噬细胞诱导VEGF的产生。

　　人类动脉瘤壁中VEGF的表达。 为了评估动物实验结果与临床的相关性，我们对人类动脉瘤病变的切片进行免疫染色，以检测VEGF的表达。在免疫组织化学中可以观察到VEGF信号，并且广泛分布于所有人类未破裂动脉瘤病例的标本中，表明在动脉瘤进展过程中VEGF有一定程度的持续产生。

　　综合以上结果可能表明，在导致动脉瘤破裂的过程中，除了持续产生VEGF外，还有来自浸润巨噬细胞的VEGF积累。此外，人类动脉瘤病变中VEGF组成性表达的结果可能表明，动脉瘤穹窿部需要靠近脑表面的动脉，并且脑脊液腔的塌陷和蛛网膜的破坏（这可能是阻止新生血管迁移的物理屏障）是必要的。

　　VEGF依赖性从脑表面动脉诱导滋养血管。 为了证实VEGF从脑表面动脉诱导滋养血管，我们体内检测了重组VEGF缓慢释放到蛛网膜下腔对新生血管迁移的影响。将含有重组VEGF或赋形剂的缓释薄片放置在脑表面，并通过组织学评估蛛网膜下腔中新生血管的诱导情况。结果，仅在VEGF处理侧的蛛网膜下腔中观察到带有中层平滑肌细胞层的小动脉，证实了VEGF依赖性新生血管从脑表面动脉的形成。

　　缺氧→滋养血管→炎症→破裂

　　动脉瘤破裂的完整链条被揭示

　　考虑到动脉瘤破裂导致蛛网膜下腔出血后的灾难性预后以及其在破裂前作为无症状病变的特性，破裂的潜在机制可能成为一个主要的治疗靶点。通过我们先前的研究，外膜中滋养血管的形成，为炎症细胞浸润病变提供了通道，可能是推动动脉瘤走向破裂的关键步骤。因此，促进滋养血管形成的机制可能成为一个治疗靶点。由于新生血管形成最有效的诱导剂之一是缺氧，而缺氧诱导的VEGF在此步骤中充当关键的介质，我们在本研究中检测了缺氧和缺氧诱导的VEGF表达在动脉瘤病变中的潜在作用。然后我们阐明了VEGF在动脉瘤预期破裂部位的表达。使用缺氧探针的实验揭示了颅内动脉外膜的缺氧微环境。考虑到血管生成相关因子中VEGF主要由巨噬细胞强效诱导，这类细胞的积累可能增加局部血管生成因子的浓度，从而诱导颅内动脉的迁移，导致滋养血管的形成。由于VEGF还能增加内皮屏障的通透性，局部VEGF的增加可能进一步促进巨噬细胞的积累，加剧巨噬细胞介导的炎症。

　　在此，VEGF的表达在转录水平上由NF-κB的激活诱导，我们已经阐明了该转录因子在巨噬细胞中的激活是病变中炎症反应的主要调节因子。因此，局部巨噬细胞介导的炎症环境可能进一步加速巨噬细胞分泌VEGF以及这种血管生成因子在组织中的积累。除了触发或加剧炎症反应外，巨噬细胞还通过产生VEGF在滋养血管的形成中发挥关键作用。有趣的是，缺氧诱导了促炎基因的表达，这些基因对动脉瘤的发病机制有显著贡献。在这些因子中，COX-2形成了由COX-2-前列腺素E2-EP2-NF-κB组成的正反馈环路，我们已将其确定为调节病变中慢性炎症的关键环节，而CCL2在巨噬细胞中形成了自身放大环路，为巨噬细胞介导的慢性炎症提供了场所，以维持炎症反应。

　　因此，COX-2和CCL2的诱导导致炎症反应的加剧，可能导致动脉壁的过度退化和病变的破裂。这些结果结合起来表明缺氧的多重作用：一是通过滋养血管的形成为炎症细胞的有效浸润提供通道，二是加剧炎症反应，从而触发动脉瘤的破裂。从这个意义上说，慢性炎症反应除了在病变的起始和生长中发挥作用外，仍然是调节该疾病的关键机制。这一概念与临床证据一致，即具有抗炎作用的药物如他汀类药物或阿司匹林在病例对照研究中显示出对蛛网膜下腔出血发生的抑制作用。

　　在本研究中，我们观察到滋养血管起源于附着在脑表面的动脉。形成动脉瘤的颅内动脉穿过蛛网膜下腔，并在脑脊液腔中被蛛网膜锚定。因此，颅内动脉的外膜主要与脑脊液接触。因此，不仅病变外膜与脑表面动脉之间的距离，而且脑脊液腔也成为阻止新生血管从脑表面向外膜延伸的物理屏障。动脉瘤穹窿部靠近脑表面动脉和/或脑脊液腔的塌陷可能是滋养血管形成的必要因素，从而导致病变破裂。未破裂动脉瘤病变中VEGF的持续表达（可能天然处于缺氧条件下）可能支持上述假设。在此，众所周知，动脉瘤较大的尺寸或特定的位置会显著增加动脉瘤病变的破裂风险。这两个公认的危险因素可以缩小空间，促进外膜中滋养血管的形成。近年来，通过对比MRI进行血管壁成像作为一种从众多稳定动脉瘤中分层出危险动脉瘤的诊断方法的潜力已被指出。危险病变（破裂或生长的病变）中强化的确切机制至今尚未阐明。然而，由于滋养血管中的动脉壁通常是渗漏的，而且血流缓慢，这种成像方法中的强化可能反映了我们已确定的作为触发动脉瘤破裂潜在机制的滋养血管的存在。

　　结论

　　考虑到动脉瘤破裂所致蛛网膜下腔出血的不良预后，基于发病机制开发新的预防破裂的治疗策略对社会健康至关重要。基于最近的实验发现，即滋养血管形成是通过促进炎症细胞浸润以加剧局部慢性炎症从而触发动脉瘤破裂的潜在机制，我们在本研究中探讨了调节滋养血管形成的机制。然后我们发现了诱导动脉瘤的颅内动脉外膜中存在缺氧微环境。在血管生成因子中，揭示了病变中包括浸润巨噬细胞在内的VEGF的产生，以及这种血管生成因子在体内诱导滋养血管的潜在作用。在此，由于颅内动脉在组织学上缺乏滋养血管并被脑脊液腔包围，缺氧微环境的形成可能是颅内动脉的一个特征，而局部的炎症反应可能进一步促进这种条件以诱导滋养血管。此外，病变的扩大和诸如蛛网膜等物理屏障的破坏可能导致滋养血管从脑表面动脉迁移。因此，本研究的发现揭示了缺氧微环境和缺氧诱导的VEGF产生作为触发动脉瘤破裂的机制，通过为炎症细胞提供通道以加剧病变微环境中的炎症反应的潜在作用。