神经胶质瘤干细胞的研究

　　胶质母细胞瘤是原发性恶性脑肿瘤较常见、较积极的形式。虽然近年来出现了多种治疗方法，如手术、放疗、化疗等，但胶质母细胞瘤在患者总生存期并没有显著变化。胶质瘤干细胞越来越被认为是神经胶质瘤发展、治疗抵抗力和恶性复发的驱动力。GSC具有自我更新的能力和多能性，并能诱导肿瘤的发生。

　　阐明控制GSC分子机制可能是针对开发的GBM靶向治疗提供新信息。溴基结构和额外结构蛋白是调节各种重要的生物过程，如转录调节、染色质重塑和DNA损伤修复。BET蛋白首次在NUT中线癌具有致癌作用。对急性髓细胞性白血病已知染色质调节剂的小发夹进行筛选RNA随后的研究证实，含溴结构的蛋白质4是维持溴结构的蛋白质4AML重要因素。

　　BET蛋白尤其是Brd4、已成为治疗几种癌症的重要靶点。这些发现表明Brd4可能是治疗GBM治疗目标。小分子BET抑制剂JQ1可与之竞争BET溴结构中乙酰化赖氨酸残基结合，防止溴结构中乙酰化赖氨酸残基结合BET蛋白质与染色质结合。BET溴基结构的抑制剂可以抑制溴基结构的抑制剂c-Myc临床治疗有转录Myc驱动癌症的潜在目标包括驱动癌症的潜在目标，包括GBM。

　　在几种癌症中，JQ体外和体内具有显著的抗炎和抗肿瘤作用。尽管有一些研究检查Brd4、但尚未确定GBM肿瘤发生中的作用，而且JQ1治疗GBM潜力尚未得到充分发展。

　　为了解决这些不确定性，研究人员研究了体外和体内的使用JQ1或小干扰RNA在GSC中Brd4的作用。JQ1处理的GSC转录组测序分析表明，Brd4与PI3K-AKT途径密切相关。揭示血管内皮生长因子调节GSC这部分可以解释细胞周期过程和细胞凋亡机制Brd4参与JQ1的抗肿瘤作用。Brd4在GBM发生和发展中的作用，揭示其潜在的分子机制。JQ1是治疗GBM新型抑制剂。

　　原代鼠神经胶质瘤干细胞从人神经胶质纤维酸蛋白磷酸酶张力蛋白同源物中分离出来；本研究没有细胞分离。GSC数字编码与转基因小鼠相同。hGFAP-Cre转基因的可用条件p53和Pten所有位基因CNS在谱系中单独删除p53或与Pten组合删除。神经系统急性症状。42只具有恶性神经胶质瘤的神经系统症状被分为间变性星形细胞瘤世界卫生组织。神经胶质瘤干细胞TS543。

　　CSC2078和CSC在具有表皮生长因子的神经基础培养基中培养1589，并具有碱性成纤维细胞生长。因子或分化培养基。补充表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子NeuroCultNS-A在增殖培养基中培养TS543细胞。在37°C的5％CO2中培养。将CSC2078细胞以每孔2×细胞接种到6孔板过夜。次日，CSC2078年使用三个独立的特定BRD4-的siRNA48小时。通过蛋白质印迹法确定转染效率。

　　为了确定对JQ1的剂量反应，将细胞以10000个细胞的密度一式三次接种到96孔板中，并粘附过夜。将细胞用JQ37系列稀释液°C下处理24或48h。JQ加入2倍系列稀释液。siRNA转染CSC2078细胞24.48和72小时。将细胞计数试剂盒8解决方案添加到板的每个孔中。将板在37℃孵化4小时。450使用酶标仪nm测量吸光度。对于软琼脂菌落测定，将6、500孔板中的每个孔一式三份地铺板2、500个细胞。

　　琼脂下层浓度为0.6%，上层浓度为0.4％。琼脂和神经基或NeuroCultNS-A增殖培养基按1:1的比例混合。在接种GSC10-15天后，在室温下使用0.结晶紫染色1%h之后，对五个随机显微镜视野中的菌落数进行了计数。在五个随机显微视野中使用光学显微镜×400放大倍数捕获图像。自我更新能力是通过神经球形成测定法来测量的。

　　将细胞培养在6孔平板上，一式三份，用JQ124小时，并在37℃下的siRNA48小时转染细胞。将神经球放在含有生长因子的地方NSC37以上的增殖培养基°C培养10天。10天后，对含有>50个细胞的神经球进行评分。在IX在71光学显微镜下×每孔100和200的放大倍数计数神经球的数量。数据表示球形细胞的百分比。在6孔板中接种细胞，并使用细胞JQ1和利尼24小时。

　　用siRNA转染CSC2078细胞48小时。研究人员在4°C下用1ml70%乙醇固定细胞过夜。根据制造商的规定，采用碘化丙锭染色溶液检测收集的细胞。使用流式细胞仪和ModFitLT5.0分析细胞周期。

　　用膜联蛋白V-荧光素异硫氰酸酯和PI对经媒介物，JQ1/linifanib和JQ1+Linifanib染色处理过的细胞。用二甲基亚砜处理经媒介物处理的细胞。凋亡率用早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞的总和计算。使用DeadEnd荧光TUNEL系统检测CSC2078-皮下异种移植小鼠肿瘤凋亡。使用OlympusBX53显微镜以×400放大倍数捕获细胞和肿瘤组织的图像。

　　用于定量ImageJ1.46r在每个样品的五个随机区域图像中对TUNEL阳性细胞计数。CSC1589细胞用JQ1处理24小时。将CSC1589用4%的聚甲醛固定5分钟。然后，将CSC1589用1mg/ml的Hoechst在黑暗中染色10分钟。较后，使用细胞PBS洗三次，并用OlympusBX53显微镜以×400放大率成像。

　　将GSC在苯甲基磺酰氟和放射性免疫沉淀分析裂解液中裂解，在4°C超声处理收集的裂解液，然后在4°C以12,000×g上清液作为离心15分钟的细胞裂解物。

　　将每个基因的读取计值与原始值进行比较，然后标准化地表达每千个转录本的千分之一片段。然后，研究人员使用它DESeq在筛选条件下分析不同表达的基因，并对样品的所有不同基因进行双向聚类分析。研究人员将所有基因映射到GO数据库中的术语，并计算每个术语中差异富集基因的数量。根据整个基因组，通过超几何分布计算出显著的富集基因项。

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