【INC国际大咖研究成果】成像质谱技术鉴定啮齿类动物颅内移植神经胶质瘤和髓母细胞瘤中具有预后指示价值的神经节苷脂分子种类

　　INC国际儿童脑瘤大咖、世界神经外科联合会(WFNS)执行委员会&顾问委员会成员之一的James T. Rutka教授发表研究《Imaging mass spectrometry identifies prognostic ganglioside species in rodent intracranial transplants of glioma and medulloblastoma》(成像质谱技术鉴定啮齿类动物颅内移植神经胶质瘤和髓母细胞瘤中具有预后指示价值的神经节苷脂分子种类)，以下是研究简述。

　　01. 摘要

　　基质辅助激光解吸离子化成像质谱(MALDI-MSI)技术使我们能够研究组织内脂质分子的分布。 我们采用MALDI-MSI技术鉴定了大鼠颅内同种异体移植胶质瘤组织切片以及人髓母细胞瘤小鼠颅内异种移植模型中的预后神经节苷脂。在健康的成年啮齿类动物大脑中，GM1和GD1是主要的糖脂类型。这两种神经节苷脂在颅内移植瘤中均缺失。神经节苷脂GM3在健康的成年大脑中不存在，但在大鼠胶质瘤同种异体移植模型中高表达。结合串联质谱分析，GM3(d18:1/C24:0)被鉴定为胶质瘤同种异体移植模型中最丰富的神经节苷脂种类。相比之下，人髓母细胞瘤小鼠异种移植模型则以神经节苷脂GM2(d18:0/C18:0)的显著表达为特征。总体而言，这些数据表明，基于组织的MALDI-MSI技术能够区分不同的脑肿瘤类型，有望成为临床分类和分级的实用工具。

　　02. 研究结果

　　我们首先使用MALDI-MSI技术研究了naïve成年Wistar大鼠大脑中GM1和GD1的表达和分布。GM1(d18:1/C18:0;m/z 1545;[M-H]⁻)和(d20:1/C18:0;m/z 1573;[M-H]⁻)神经节苷脂在大脑皮层中广泛存在(图1)。GD1(d18:1/C18:0;m/z 1874;[M+Na-2H]⁻ 和 d20:1/c18:0;m/z 1886;[M+Na-2H]⁻)神经节苷脂在皮层中的表达与GM1(d18:1/C18:0)神经节苷脂重叠。对GD1标准品的分析证实，在MALDI-MSI的负反射离子模式下，GD1神经节苷脂可能会失去其唾液酸部分[22]，并且由此产生的GD1衍生物在与GM1相同的质量处离子化(见S2图)。通过霍乱毒素B亚单位(CTB)染色(图2B)也确定了大脑中GM1的分布，CTB可与GM1结合。CTB染色显示GM1存在于皮层下的白质中，而在皮层中表达较少。因此，MALDI-MSI在皮层中检测到的GM1部分可能是由于GD1的碎片化。此外，GD1神经节苷脂在皮层中特别丰富。因此，我们将1545和1573 m/z处的峰标记为GM1/GD1-唾液酸(GM1/GD1-sa)。此外，改变离子的尺度和强度显示GM1也定位于白质(见S3图)。在含有胶质瘤颅内同种异体移植的大鼠大脑区域中，GM1和GD1神经节苷脂的定位未发生改变(图2A)。然而，这两种神经节苷脂在肿瘤中缺失(图2A，圆圈)。大鼠胶质瘤的阴性CTB染色(图2B)证实了我们使用MALDI-MSI的GM1发现(图2A)。神经菌株蛋白-1(NRP-1)免疫组化(图2B)阳性鉴定胶质瘤细胞。NRP-1是一种细胞表面糖蛋白，在许多癌症中高度表达，包括胶质瘤和髓母细胞瘤。对照大鼠大脑和大鼠胶质瘤颅内同种异体移植也分析了GM2和GM3的存在。虽然在对照组和同种异体移植大脑切片中未检测到GM2(d18:0/c18:0;m/z 1385;[M-H]⁻)神经节苷脂(S4图)，但GM3(d18:1/C24:0神经酰胺;m/z 1264;[M-H]⁻)仅定位于胶质瘤移植区域(图3A)。具体而言，MALDI-MSI和H&E的合并强烈表明GM3(d18:1/C24:0)在胶质瘤同种异体移植中的独特表达(图3B)。此外，MALDI-MSI与H&E的合并突出显示了胶质瘤同种异体移植中GM1神经节苷脂的缺失(图3B)。我们通过LC-MS/MS分析证实了MALDI-MSI数据。从80-μm厚的大脑冷冻切片(S5A图)中切下胶质瘤同种异体移植和相应的非病理区域，并进行糖鞘脂提取和串联质谱检测。LC-MS/MS分析证实了与非病理大脑组织相比，胶质瘤同种异体移植中GM1向GM3神经节苷脂分布的变化(S5B和S5C图)。

　　胶质瘤中有代表性的GM3亚型是GM3(d18:1/C24:0;m/z 1264)。在负模式下对m/z 290片段进行前体离子扫描，确认了该质量峰的神经节苷脂身份。此外，GM1/GM3标准品与胶质瘤糖鞘脂提取物之间的质谱比较验证了癌症中存在的GM3物种包含d18:1/C24:0神经酰胺(S5D图)。然后，我们使用相同的方法分析了人髓母细胞瘤的小鼠颅内异种移植。我们最初检查了naïve成年小鼠大脑中GM1和GD1的表达和分布，发现这两种神经节苷脂的分布(图4)与大鼠大脑(图1)匹配。在植入人髓母细胞瘤的小鼠大脑中，这两种神经节苷脂的分布得以维持(图5A)。然后通过MALDI-MSI检查人髓母细胞瘤的颅内异种移植中GM2和GM3的存在。与胶质瘤同种异体移植相比，髓母细胞瘤异种移植中未检测到GM3(d18:1/C24:0)(图5A)。只有内标(IS)可见。然而，MALDI-MSI显示GM2物种(d18:0/C18:0神经酰胺;m/z 1385;[M-H]⁻)仅定位于髓母细胞瘤异种移植区域(图5A和5B)。MALDI-MSI和H&E的合并证实了髓母细胞瘤异种移植中GM2(d18:0/C18:0)的表达(图5D)。通过NRP-1免疫组化(图5C)阳性鉴定髓母细胞瘤细胞。

　　图1 成年大鼠大脑中GM1和GD1的MALDI-MSI分析。健康成年Wistar大鼠大脑中GM1/GD1-唾液酸([M-H]⁻)d18:1(m/z 1545)和20:1(m/z 1573)、GD1([M-H]²⁻)d18:1(m/z 1874)和20:1(m/z 1886)的MSI及质谱图。离子强度根据提供的强度尺度以颜色表示。箭头指示MSI中可视化的峰。GD1-sa = GD1-唾液酸。

　　图2 大鼠胶质瘤颅内同种异体移植中的GM1和GD1的MALDI-MSI分析。(A) GM1/GD1-唾液酸([M-H]⁻)d18:1(m/z 1545)和20:1(m/z 1573)、GD1([M+Na-2H]⁻)d18:1(m/z 1874)和20:1(m/z 1886)的MSI。离子强度根据提供的强度尺度以颜色表示。(B) 通过CTB和抗NRP1抗体分别对GM1和NRP-1进行免疫染色，显示大鼠胶质瘤颅内同种异体移植中的分布。圆圈指示异种移植的位置。比例尺：5毫米。GD1-sa = GD1-唾液酸。

　　图3 大鼠胶质瘤颅内同种异体移植中的GM3的MALDI-MSI分析。(A) 大鼠胶质瘤颅内同种异体移植中GM3([M-H]⁻)d18:1/24:0(m/z 1264)和d18:0/20:1(m/z 1208)的MSI。离子强度根据提供的强度尺度以颜色表示。(B) 大鼠胶质瘤颅内同种异体移植中GM1/GD1-唾液酸(d18:1/C18:0)和GM3(d18:1/C24:0)的分子组织学分布。红色方框指示胶质瘤异种移植的位置。比例尺：5毫米。GD1-sa = GD1-唾液酸。

　　图4 成年小鼠大脑中GM1和GD1的MALDI-MSI分析。(A) 健康成年小鼠大脑中GM1/GD1-唾液酸([M-H]⁻)d18:1(m/z 1545)和20:1(m/z 1573)、GD1([M+Na-2H]⁻)d18:1(m/z 1874)和20:1([M+K-2H]⁻)(m/z 1902)的MSI及质谱图。离子强度根据提供的强度尺度以颜色表示。箭头指示MSI中可视化的峰。(B) 健康成年小鼠大脑中GM1/GD1-唾液酸和GD1种类分布的重叠情况。比例尺：4毫米。GD1-sa = GD1-唾液酸。

　　图5 人髓母细胞瘤颅内异种移植中的神经节苷脂MALDI-MSI分析。(A) 人髓母细胞瘤颅内异种移植中GM1/GD1-唾液酸([M-H]⁻)d18:1(m/z 1545)和20:1(m/z 1573)、GD1([M-H]²⁻)d18:1(m/z 1874)和20:1(m/z 1902)、GM3([M-H]⁻)d18:1/c24:0(m/z 1264)和GM2([M-H]⁻)d18:0/c18:0(m/z 1385)的MSI。离子强度根据提供的强度尺度以颜色表示。(B) 人髓母细胞瘤颅内异种移植中GM2(d18:0/C18:0)的质谱图。(C) 使用抗NRP1抗体对髓母细胞瘤颅内异种移植中的神经菌株蛋白-1(Neuropilin-1)进行免疫染色显示其分布。插图是胶质瘤区域的40倍放大图。(D) 人髓母细胞瘤颅内异种移植中GM2(d18:0/C18:0)的分子组织学分布。方框指示髓母细胞瘤移植的位置。比例尺：4毫米。GD1-sa = GD1-唾液酸。

　　03. 研究结论

　　我们利用MALDI-MSI技术展示了正常成年啮齿动物大脑以及大鼠胶质瘤和人髓母细胞瘤颅内移植模型中各种神经节苷脂的表达和分布。与先前报道一致，正常啮齿动物大脑中的主要神经节苷脂为GM1和GD1.在MALDI-MSI的负反射离子模式下，GD1可能失去其唾液酸部分，并在此时被检测为GM1种类。大鼠和小鼠大脑中GM1和GD1神经节苷脂的类似分布以及GM1的白质CTB染色支持了皮层中的GM1信号部分来源于GD1神经节苷脂的观点。

　　多项研究报道了脑癌中异常的神经节苷脂表达以及这些糖鞘脂在脑肿瘤发展、进展和治疗中的作用[33. 34]。通过MALDI-MSI，我们鉴定出GM3是大鼠胶质瘤同种异体移植中主要的神经节苷脂种类。GM3是最简单的神经节苷脂寡糖，是大多数更复杂神经节苷脂种类(包括GD3、GM2和GD2)的前体。在妊娠21至25周期间，GM3在人类小脑中强烈表达，这是一个细胞增殖旺盛的时期。到27周时，其表达显著减少，GM3在出生后第二个月几乎完全消失。相比之下，GM3在肿瘤组织中过表达，是肿瘤细胞中常见的神经节苷脂类型。GM3的作用主要在肿瘤细胞凋亡和药物耐受方面进行了研究。目前尚不清楚GM3(d18:1/C24:0)种类是否参与这些过程，因为在以往的研究中未确定GM3的化学结构。脑肿瘤中的神经节苷脂谱已被证明与肿瘤的组织病理学起源、恶性程度、侵袭性和进展相关。

　　在本研究中，我们发现MALDI-MSI筛查神经节苷脂能够区分两种类型的脑癌。MALDI-MSI通过表达GM2神经节苷脂鉴定髓母细胞瘤异种移植，而胶质瘤同种异体移植则表达GM3.MALDI-MSI未在髓母细胞瘤异种移植中发现任何GM3种类，尽管有报道称GM3约占人Daoy髓母细胞瘤细胞系总神经节苷脂的13%[4]。众所周知，原位细胞与培养细胞具有不同的表达模式，因此Daoy来源的髓母细胞瘤原位可能不表达GM3.或者，GM3浓度低于MALDI-MSI的检测限，或者照射区域过小。

　　研究表明，MALDI-MSI检测到的分析物量随空间分辨率的平方减少[44]。通常，GM2在大多数组织中是微量神经节苷脂，但在某些癌细胞(包括Daoy髓母细胞瘤细胞系)中高度表达。由于组织量有限，我们无法通过LC-MS/MS确认颅内髓母细胞瘤异种移植中GM2种类的身份。然而，我们的MALDI-MSI观察结果表明，GM2是颅内髓母细胞瘤异种移植中突出的神经节苷脂之一，这与以往发现一致。

　　总之，分子成像是一种允许对参与癌细胞结构和功能异常的分子(如神经节苷脂)进行组织学研究的技术。在此，我们提供了MALDI-MSI能够区分不同脑肿瘤表达的各种神经节苷脂分子种类的证据。未来，可能可以将质谱成像技术应用于脑肿瘤的常规临床鉴别。

　　04. 关于作者

国际儿童脑肿瘤大咖 James T. Rutka教授

　　教授是世界神经外科联合会(WFNS)执行委员会&顾问委员会成员之一，发表超过500多篇的文章，在临床上的研究方向以颅内肿瘤为主，对胶质瘤、纤维瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤具有多年的临床经验，擅长清醒开颅术、显微手术和被广泛用于治疗恶性脑瘤和癫痫的国际前沿技术激光间质热疗(LITT)技术经验，对于儿童胶质瘤，尤其是高级别胶质瘤开展多项临床试验，其所在的医院加拿大SickKids是国际知名的儿童医院之一。

　　INC 国际小儿神外专家团

　　国际儿童脑肿瘤大咖 James T. Rutka教授

　　教授是世界神经外科联合会(WFNS)执行委员会&顾问委员会成员之一，发表超过500多篇的文章，在临床上的研究方向以颅内肿瘤为主，对胶质瘤、纤维瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤具有多年的临床经验，擅长清醒开颅术、显微手术和被广泛用于治疗恶性脑瘤和癫痫的国际前沿技术激光间质热疗(LITT)技术经验，对于儿童胶质瘤，尤其是高级别胶质瘤开展多项临床试验，其所在的医院加拿大SickKids是国际知名的儿童医院之一。

　　国际儿童神外专家 Concezio Di Rocco教授

　　自2014年5月起，Di Rocco教授就担任了德国汉诺威国际神经科学研究所(INI)的儿科神经外科主任。从事儿童神外事业50余年，Di Rocco教授尤为擅长小儿神经纤维瘤、癫痫、脑积水、蛛网膜囊肿、颅缝早闭、脑和脊髓肿瘤、脑和脊柱畸形(半椎体畸形，皮质发育不良，脊髓脊膜膨出，脊髓内脂肪瘤，Arnold-Chiari畸形等)难治病症方面的治疗，曾进行过12000多次神经外科手术。

　　国际脑干手术大咖 Helmut Bertalanffy教授

　　教授擅长颅底、脑干病变、功能区、大脑小脑、脊髓等复杂位置的肿瘤性、血管性疾病的手术治疗，尤其擅长颅底、脑干等复杂区域病变的肿瘤切除术、神经吻合术等，脑干病变成功手术病例近千台，以精湛高超的手术技术不损伤神经功能且全切病变。巴教授历经千万个小时用超精确的物理剥除诠释了医术为何为艺术。