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神经胶质瘤的病因,是如何引起的?

栏目:神外前沿|发布时间:2022-11-23 14:55:20 |阅读: |神经胶质瘤的病因
巴特朗菲教授
推荐教授:巴特朗菲教授(Helmut Bertalanffy)
所在医院:德国汉诺威国际神经外科研究所(INI)

  神经胶质瘤是中枢神经系统中最常见的恶性肿瘤之一,具有很高的死亡率和发病率。神经胶质瘤的疗效主要取决于肿瘤的分子特征。影像学是临床观察的重要来源之一,可提供对低尺度性质的洞察力,也可用于诊断。

  寻找对神经胶质瘤治疗的分子靶点对研究人员至关重要。长的非编码RNA,超过200个碱基对,是一系列无蛋白质编码功能的转录物。异常的lncRNA已被暗示与癌症的发生和发展有关,例如细胞增殖,细胞周期,细胞凋亡和细胞迁移。

  LncRNAGACAT3通过IL-6信号通路促进胃癌细胞增殖;BLACAT1通过激活信号通路促进宫颈癌细胞的增殖,迁移和侵袭;lncRNAMA-linc1对于细胞周期进程是必需的,并且可以提高癌细胞对紫杉醇的敏感性。

  位于染色体21q22.3的LncRNA长基因间非蛋白质编码RNA319已暴露在一系列肿瘤中发挥致癌作用,包括卵巢癌,肺癌,鼻咽癌和皮肤鳞状细胞癌,但在神经胶质瘤中不是。它对癌症的生物学过程也有积极影响,特别是细胞增殖,迁移,周期和细胞凋亡。但是,LINC00319在神经胶质瘤中的作用尚待探索。

神经胶质瘤的病因,是如何引起的?

  转录因子IID与启动子DNA结合以募集RNA聚合酶II和其他用于转录的基本因子,负责大多数mRNA的表达。TFIID复合物的一个主要组成部分-TATA盒结合蛋白相关因子1由以前未表征的保守锌指结构域编码。

  尽管已研究出TAF1作为胃癌的潜在标志物,肝细胞癌和三阴性乳腺癌,TAF1在乳腺癌中的存在仍然难以捉摸。高迁移率族AT-hook2被认为是许多癌的癌基因,包括胃癌,肺癌,肝癌和结直肠癌等。

  还发现它促进神经胶质瘤的细胞侵袭,干性和肿瘤发生。观察到LINC00319在神经胶质瘤中上调,并且与神经胶质瘤患者的不良预后密切相关。敲低LINC00319会损害神经胶质瘤的细胞增殖,阻断细胞周期并诱导细胞凋亡。

  HMGA2在神经胶质瘤中过表达,这与LINC00319的表达也呈正相关。此外,LINC00319与TAF1结合以调节HMGA2。最后,救援分析证实LIN00319通过TAF1调节HMGA2来调节神经胶质瘤的肿瘤发生。研究旨在探讨LINC00319在神经胶质瘤中的表达模式及其潜在机制。

  经诊断为原发性神经胶质瘤并进行了手术切除的患者中,获得了72份匹配的临床肿瘤标本和邻近的非肿瘤组织。立即将样品在-80°C冷冻保存,以进行以下研究。人神经胶质瘤细胞系U87,U251,T98G和SHG44。

  将细胞在RPMI1640或Dulbecco改良的Eagle's培养基中孵育,该培养基用0.1%青霉素和10%胎牛血清处理。正常人星形胶质细胞从Lonza获得,并保存在CloneticsAGM星形胶质细胞生长培养基中,用10%FBS和1%抗生素-抗真菌剂处理。

  将细胞在加有5%CO的加湿培养箱中于37°C进行培养。关于细胞转染,使用了靶向LINC00319的shRNA和过表达质粒。所有这些载体和阴性对照均由Genepharma设计和合成。用Lipofectamine2000试剂转染细胞。

  48小时后,实时定量聚合酶链反应用于检测转染的有效性。使用TRIzol试剂根据制造商的方案分离细胞的总RNA。为了进行细胞周期的流式细胞术分析,首先将细胞接种到6孔板中。

  随后,收获用指定质粒转染的细胞,并通过冰冷的磷酸盐缓冲盐水洗涤,并用70%乙醇固定过夜,然后在37°C的黑暗中使用碘化丙啶染色30分钟。将细胞与乙醇在黑暗中于4°C孵育15分钟后,通过备有CellQuest软件的仪器,通过流式细胞仪对细胞进行分析。

  为了进行细胞凋亡的流式细胞术分析,将细胞接种到6孔板中并培养48小时。通过胰蛋白酶提取细胞,并用PBS洗涤。根据制造商的规程,使用了BDPharmingen-FITCAnnexinV细胞凋亡检测试剂盒使细胞染色。

  为了进行动物研究,用于动物实验的四周龄雌性无胸腺裸鼠可从国家实验动物中心商购获得。将处理过的细胞皮下注射到裸鼠的左胁。计算肿瘤体积和重量。四周后,将小鼠杀死并切除。切除癌组织并称重以进一步研究。

  如先前所述进行亚细胞分级测定。使用FISH染色测量LINC00319的细胞分级分离度。通过应用Lipofectamine2000,进行荧光素酶报告基因测定。建立具有HMGA2启动子的荧光素酶报告载体pGL3。

神经胶质瘤的病因

  将PGL3-HMGA2启动子与pcDNA3.1或pcDNA3.1-TAF1共转染到HEK-293T细胞中。转染后48小时,利用双重荧光素酶报告基因测定系统检测荧光素酶活性。海肾荧光素酶活性用于标准化。

  麦格纳ChIP试剂盒投入使用,进行ChIP实验。甲醛用于交联DNA和蛋白质30分钟。通过细胞提取物的超声处理产生200–1000bp的染色质片段。使用抗TAF1和抗IgG进行免疫沉淀。输入用作正控制。最后,利用qRT-PCR分析沉淀的染色质DNA。

  根据提供的方案,通过MagnaRIPTMRNA结合蛋白免疫沉淀试剂盒进行RIP分析。收集80-90%汇合的细胞并使用RIP裂解缓冲液裂解。随后,将一百微升细胞提取物用RIP缓冲液培养,该缓冲液包含与人抗TAF1抗体或阴性对照抗IgG偶联的洗涤链霉亲和素磁珠。

  样品用蛋白酶K培养以消化蛋白质,然后分离免疫沉淀的RNA。通过qRT-PCR分析检测纯化的RNA。数据显示为平均值±标准偏差。所有实验均独立重复至少3次。两组之间的差异采用Student'st检验进行分析,另外两组采用单向方差分析进行分析。

  为了探讨LINC00319是否与神经胶质瘤有关,首先测试了其在肿瘤和非肿瘤组织中的表达。LINC00319在肿瘤组织和处于晚期病理阶段的组织中相对较高。检查LINC00319在人神经胶质瘤细胞系和正常人星形胶质细胞中的表达。

  在神经胶质瘤细胞系中LINC00319水平显着高。LINC00319的较高表达导致较低的总生存率。神经胶质瘤患者的临床特征表明,LINC00319在神经胶质瘤中的高表达与WHO明显相关,但与性别,年龄或肿瘤位置无关。多变量分析显示,WHO和LINC00319表达是神经胶质瘤的两个独立的预后生物标志物,所有这些数据表明,过表达的LINC00319与神经胶质瘤的不良预后密切相关。

  为了进一步研究LINC00319在神经胶质瘤中的功能,进行了功能丧失试验。在显示最高水平的LINC00319的U87和U251细胞中,将靶向LINC00319的特定shRNA与sh-NC一起用作阴性对照。

  如通过qRT-PCR确定的那样,通过构建的shRNA,特别是通过sh-LINC00319#2,LINC00319表达被惊人地沉默。CCK-8分析显示LINC00319的下调抑制了U87和U251细胞的增殖。在流式细胞仪细胞周期实验中,LINC00319的沉默导致U87和U251细胞的G0期停滞更大比例。流式细胞仪细胞凋亡分析发现,与sh-NC组相比,LINC00319敲低产生更多的凋亡细胞。

  总之,LIN00319下调抑制神经胶质瘤中的细胞增殖,阻滞细胞周期并促进细胞凋亡。已知LncRNA会调节肿瘤中的基因表达,从而影响生物学过程。为了寻找神经胶质瘤中LINC00319的靶mRNA,应用微阵列分析来确定响应LINC00319的下调的差异表达的mRNA。结果,除了947个上调的mRNA外,在LINC00319下调的细胞中还有1304个mRNA显着下调。由于其最高的倍数变化,选择了前33个下调的mRNA。

  其中,HMGA2已被证明在肿瘤进展中起关键作用。LINC00319可以介导HMGA2影响神经胶质瘤的进展。

  首先,测量了HMGA2在神经胶质瘤组织和正常组织中的表达。qRT-PCR证实了HMGA2在肿瘤组织中的表达高于非肿瘤组织。并且通过Spearman相关曲线在神经胶质瘤组织中观察到LINC00319与HMGA2的正相关。HMGA2在神经胶质瘤细胞中的表达高于在NHA中的表达。在U87和U251细胞中敲低LINC00319后,HMGA2的mRNA水平相应降低。为了分析LINC00319在基因表达中的潜在调控机制,通过亚细胞分级分离和FISH检测了其在细胞中的定位。

  表明LINC00319位于在两个细胞质和细胞核。所有这些结果表明,HMGA2在神经胶质瘤中高表达,并受到LINC00319的正向调控。

  为了分析LINC00319调节神经胶质瘤中HMGA2的潜在机制,进行了RNA下拉和质谱分析。其中,TAF1是具有相对较高的富集得分的转录因子。Western印迹的结果揭示了LINC00319和TAF1之间的相互作用。进一步进行RIP测定,结果表明LINC00319可以与TAF1结合,qRT-PCR分析表明LINC00319对TAF1没有调节作用。从UCSC基因浏览器中,获得了TAF1和HMGA2启动子之间的潜在相互作用。在U87和U251细胞中过表达TAF1以检查HMGA2的表达变化。HMGA2明显上调。

  确定了TAF1和HMGA2启动子之间的相互作用。发现TAF1的过表达诱导HMGA2启动子的荧光素酶活性增加。TAF1对HMGA2启动子的亲和力通过ChIP分析进一步证实,LINC00319的下调降低了HMGA2启动子的萤光素酶活性。但是,导入TAF1可以恢复HMGA2启动子的荧光素酶活性降低。同样,通过与pcDNA3.1-TAF1共转染可挽救因LINC00319沉默而导致的TAF1对HMGA2启动子的亲和力降低。

  最后,将sh-LINC00319#2和pcDNA3.1-TAF1单独或联合转染到U87和U251细胞中。LINC00319的下调降低了HMGA2mRNA的表达,这被TAF1的上调逆转了。综上所述,LINC00319通过增强招募TAF1至HMGA2启动子来介导HMGA2表达。

  进行了拯救试验以验证LINC00319在神经胶质瘤中的调节机制。用sh-LINC00319#2和pcDNA3.1-HMGA2单独或组合处理U87和U251细胞。HMGA2在U87和U251细胞中过表达后,qRT-PCR表现出HMGA2的高表达。

  CCK-8实验表明,LINC00319的沉默抑制了U87和U251细胞的增殖,这可以通过HMGA2的过表达来挽救。流式细胞仪细胞周期分析表明,HMGA2过表达可以消除LINC00319敲低对U87和U251细胞周期的抑制作用。

  随后,在流式细胞仪细胞凋亡测定中,在LINC00319下调下,U87和U251细胞的细胞凋亡率增加,这通过HMGA2上调被废止。实验结果表明,HMGA2的过表达可以挽救LIN00319敲除诱导的胶质瘤肿瘤发生的抑制作用。

  为了进一步证明LINC00319在神经胶质瘤中的致癌作用,进行了动物研究。注射后28天,收集肿瘤。发现与sh-NC组相比,sh-LINC00319组的肿瘤生长降低。肿瘤的体积和重量呈现出相同的趋势。

  检查了sh-LINC00319组中LINC00319的低表达水平。与sh-NC组相比,sh-LINC00319组也观察到ki-67阳性和HMGA2表达降低。

  胶质瘤是最常见的原发性颅内肿瘤,占恶性脑肿瘤的81%。由于预后不良,因此具有侵略性。成像是诊断神经胶质瘤的有效方法,而分子疗法仍是神经胶质瘤的主要治疗方法。这项研究的重点是研究神经胶质瘤肿瘤发生的新型分子途径。

  长非编码RNA的异位表达在肿瘤的生物学过程中起着重要的作用。发现LncRNA长的基因间非蛋白编码RNA319促进卵巢癌,肺癌,鼻咽癌的进展和皮肤鳞状细胞癌。

神经胶质瘤是如何引起的?

  这是首次在神经胶质瘤中对LINC00319进行了调查。LINC00319在神经胶质瘤样本中过表达,并且与神经胶质瘤患者的不良预后密切相关。这项研究纳入了LINC00319与神经胶质瘤患者临床特征之间的相关性。LINC00319是可能与神经胶质瘤的肿瘤发生相关的lncRNA。LINC00319增强了癌细胞的细胞活性,主要涉及细胞增殖,迁移,周期和凋亡等。功能丧失测定法证实LIN00319敲低可抑制神经胶质瘤的细胞增殖,阻滞细胞周期并诱导细胞凋亡。

  证实了上调的LINC00319是神经胶质瘤肿瘤发生的致癌因素。LncRNA通过调节基因表达在肿瘤中发挥其功能。通过微阵列分析和qRT-PCR分析,研究人员确定LINC00319在神经胶质瘤组织和细胞系中正调控HMGA2。HMGA2已被鉴定为许多癌症中的癌基因。它已被证实有助于神经胶质瘤中的细胞侵袭,干性和肿瘤发生。在过去的调查中,转录因子被宣布与lncRNA结合并进一步激活特定基因。

  在当前的研究中LINC00319是否通过HMGA2在神经胶质瘤中发挥功能。通过机制研究,确定TAF1可以与LINC00319相互作用并调节HMGA2的转录。TAF1先前已被报道为胃癌,肝细胞癌和三阴性乳腺癌的潜在标志物。TAF1首次在神经胶质瘤中研究。

  所有机理研究均表明,LINC00319通过将TAF1募集至HMGA2启动子来上调HMGA2表达。最后,救援分析证实LINC00319通过调节HMGA2调节了胶质瘤的肿瘤发生。LINC00319通过TAF1激活的HMGA2与胶质瘤的肿瘤发生和不良预后有关。本文揭示了LINC00319作为神经胶质瘤诊断和预后标志物的作用。

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