侵袭性脑肿瘤——神经胶质瘤

　　胶质瘤是一种破坏性侵袭性脑肿瘤，占所有颅内肿瘤的30-40%。胶质瘤:概述当前的分类、特征、分子生物学和靶向治疗。它是世界上中枢神经系统肿瘤死亡的主要原因之一。由于胶质瘤是一种高度侵袭性的肿瘤，手术很难完全切除。为了提高胶质瘤患者的预后，手术后需要辅助放疗和化疗。多形性胶质母细胞瘤的中位生存率仅为系统评价脊髓多形性儿童原发性胶质母细胞瘤整体存活率10个月左右。目前，进一步研究的重点是肿瘤的分子机制，以找出胶质瘤的具体治疗目标。

　　大量证据表明，胶质瘤的发生与各种癌基因的激活有关，包括Ras家族基因。胶质母细胞瘤纳米囊泡含有细胞内信号传导蛋白和法尼基化依赖的活性Ras。Ras家庭包括三个成员：K-Ras，H-Ras和N-Ras。其中，K-Ras被发现对维持胶质母细胞瘤至关重要的信号在维持胶质母细胞瘤中起着重要作用。K-Ras癌症患者常发生突变，如结肠直肠癌微卫星的不稳定性和不稳定性RAS基因突变与Ⅲ期结直肠癌的相关性。和贲门癌患者K-ras突变和fascin表达分析。

　　Ras通过作为GDP-GTP调节的二元开关驱动肿瘤的发生，调节和控制肿瘤细胞生长和转移的各种信号通道和癌症突变一目了然。已知Ras突变激活各种信号传输方式，包括MAPK，ERK和PI3K。KRAS突变驱动腺瘤样牙源性肿瘤，不依赖临床病理特征。功能性KRAS突变和PI3K激活在Wilms肿瘤的潜在作用。这些靶向信号传导被认为是治疗Ras人类癌症突变的新策略l。功能性KRAS突变和PI3K激活在Wilms肿瘤的潜在作用。虽然目前的研究表明Ras突变在人类癌症中的致癌功能很广泛，但强调其功能的确切机制尚不清楚。

　　组蛋白是真核细胞中的一种基本蛋白质，由四个成员组成：H1，H2A，H2B和H4。基因表达的功能主要取决于对特定氨基酸残基的翻译和修饰。人类表观基因组分析采用组蛋白修饰。对于选定的例子，通过去甲基化酶KDM5B抑制组蛋白H赖氨酸4上的三甲基化与基因组沉默中的缺陷有关。早期哺乳动物发育组蛋白修饰H3K4me3的等位基因重编程。

　　组蛋白H3.赖氨酸27乙酰化增加了转录因子的表达，包括NRF1，GABPA和MEF2A。组蛋白H3K27乙酰化的全基因组分析特征在于胰腺B细胞中脂肪酸信号在小鼠饮食诱导的肥胖中的传导。

　　组蛋白H1.5是组蛋白H体细胞亚型为稳定的染色质结构，基因表达，DNA修复和细胞增殖的关键调节因子蛋白H1.5.一种新型的前列腺癌标志物：免疫组化研究与各种人类癌症如前列腺癌有关。卵巢颗粒细胞瘤在颗粒细胞瘤和正常卵巢组织中的表现:子宫平滑肌瘤和子宫肌瘤中早幼粒细胞白血病锌指和组蛋白1.5的免疫组化检测。

　　本文旨在研究组蛋白H1.5修饰是否参与Ras-AKT激活诱导的胶质瘤进展。除此之外，研究了Ras-AKT信号如何改变组蛋白H1.5修饰。本研究的结果将更好地理解Ras的致癌功能。

　　在指定的转染后，将细胞在密度为5000个细胞的96孔板中孵育48小时。通过细胞增殖和细胞毒性测定试剂盒测量细胞的存活力。通过酶联免疫吸附测定读数器记录570nm处的光密度值以评估细胞活力。通过将琼脂糖溶液与细胞培养基混合制备约0.35和0.6％的低熔点琼脂糖。将转染的A172细胞悬浮于0.35％低熔点琼脂糖中，并置于六孔板上，所述六孔板预涂有0.6％低熔点琼脂糖。在37℃温育2周后，用显微镜计数菌落数。

　　通过使用具有8-um孔滤器的Transwell系统测试转染后A172细胞的迁移能力。系统的上室充满细胞悬浮液，其通过将A172细胞悬浮在无血清培养基中制备。下室充满完全生长培养基。二十四小时后，下侧的细胞用0.5％结晶紫染色，并用乙酸收集。

　　读取570nm处样品的OD值以评估细胞迁移。收集转染的A172细胞并在4℃下在70％乙醇中固定过夜。将细胞重悬于含有0.2mg每毫升碘化丙啶和0.2mg每毫升无DNA酶RNA酶A的溶液中。在室温下在暗室中染色30分钟后，使用EpicsXL流式细胞仪分析细胞。通过ModFit软件分析每个细胞周期阶段中细胞的百分比，木瓜蛋白酶产生的酪蛋白和大豆蛋白水解物对成骨细胞的体外增殖和抗凋亡。将转染的A172细胞在室温下孵育1％甲醛用于交联。

　　10分钟后，用十二烷基硫酸钠裂解缓冲液裂解细胞，并在超声浴中超声处理裂解物。通过使用针对H1.5T10ph的一抗。由GSK-3在苏氨酸10处的组蛋白H1.5的M期特异性磷酸化。使用正常的抗IgG抗体作为内部对照。然后将蛋白质A-琼脂糖鲑鱼精子DNA珠子加入到样品中，并如前所述用盐溶液洗涤沉淀物Akt激酶靶向CBP与组蛋白H3的结合以调节赖氨酸K18的乙酰化。从沉淀中洗脱DNA并进行qRT-PCR以分析靶mRNA的富集。

　　通过使用RIPA裂解缓冲液从转染的A172细胞中提取总蛋白质。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离提取的蛋白质，并转移到聚偏二氟乙烯膜上。通过使用一抗在4℃过夜进行免疫印迹，然后通过二抗在室温下探测1小时。由BeyoECLPlus试剂盒开发。通过Gel-ProAnalyzer4.0软件分析目标条带的强度。

　　研究H1.5T10ph在Ras驱动的肿瘤细胞生长和迁移中的作用。A172细胞的存活性显著增加通过转染的Ras达质粒。用增加量的转染细胞显着降低了A172细胞的活力。

　　在集落形成和transwell测定的结果中观察到相同的趋势。Ras显着增加了菌落数和迁移能力。Ras增加的菌落数和迁移通过转染而减弱。H1.5T10ph可以抑制Ras突变诱导的A172细胞的生长和迁移。这些基因转录的影响。H1.5T10ph的富集物在这些基因组位点。这些数据共同表明H1.5T10ph能够调节这些基因的转录。

　　GSK3是一种催化在T10催化H1.5磷酸化的激酶由GSK-3在苏氨酸10处的组蛋白H1.5的M期特异性磷酸化。H1.5T10ph由下降表达的Ras回收通过转染GSK3-HA。GSK3-HA的转染效率其中在凝胶电泳中观察到GSK3的mRNA水平。GSK3在Ras-AKT活化诱导的A172细胞生长和迁移中的作用。细胞存活率和迁移增加的Ras都是由过表达GSK3。GSK3过表达使G0期细胞停滞更多，S期细胞百分比下降。

　　GSK3催化H1.5T10ph抑制Ras-AKT活化诱导的A172细胞的生长和迁移。进一步的研究旨在将Ras-AKT信号传导与GSK3联系起来，因为这两者与H1.5T10ph密切相关。凝胶电泳结果显示，Ras对GSK3mRNA的表达没有改变。外源和内源水平的GSK3蛋白都被Ras。结果表明GSK3在Ras-AKT激活后转录后下调。ChIP结果显示Ras下游基因的基因组位点GSK3的富集显着下降，GSK3也能够调节这些基因的转录。

　　然后，蛋白酶体抑制剂MG132用于治疗A172细胞。Ras没有通过添加MG132的下调GSK3的外源性水平，表明的Ras-AKT信号传导经由依赖蛋白酶体的方式抑制GSK3的表达。通过添加MG132逐渐恢复Ras抑制的H1.5T10ph的表达。Ras-AKT信号通过GSK3的降解抑制了T10的H1.5磷酸化。Ras-AKT活化如何降解GSK3。如上所述，Ras-AKT激活的抑制GSK3表达是通过蛋白酶体依赖性方式进行的。

　　研究人员专注于研究MDM2，这是一种控制蛋白酶体介导的降解的着名蛋白质连接酶活性的乙酰化依赖性调节决定了其致癌功能。以揭示的Ras-AKT激活是否通过MDM2降解GSK3。MDM2-His显着下调GSK3蛋白的外源和内源水平。通过用突变型MDM2转染未观察到这种下调。Ras可以上调MDM2表达。通过siRNA转染的MDM2沉默恢复了由Ras抑制的H1.5T10ph表达。

　　与其他核心组蛋白一样，H1.5的N-和C-末端尾部经历各种翻译后修饰，包括甲基化，乙酰化，磷酸化等。这些翻译后修饰能够改变染色质结构的稳定性，从而调节基因表达，较终发挥细胞生物学过程的作用，包括细胞增殖，迁移，分化，死亡和肿瘤发生。磷酸化是H1.5较着名的修饰之一。H1.5中有20个氨基酸残基可被磷酸化。认为不同的磷酸化使H1.5具有不同的功能间期H1磷酸化：染色质中的调节和功能。

磷酸化的重要性仍不清楚。目前的工作发现，Ras-AKT活化能够抑制A172细胞中苏氨酸10的H1.5磷酸化。H1.5T10ph减弱了Ras-AKT激活诱导的A172细胞不受控制的生长和迁移。揭示Ras-AKT通过MDM2依赖性GSK3降解抑制H1.5T10ph。

　　快速生长和转移是恶性肿瘤的重要特性。它们也是癌症复发的主要因素。胶质瘤是较具侵袭性的脑肿瘤，具有高侵袭性和不良预后。Ras突变经常发生在胶质瘤中。和Ras突变导致宽范围的信号通路，包括AKT的激活。RAS信号传导和抗RAS治疗：从基因工程小鼠模型，人类癌细胞和患者相关研究中吸取的经验教训。

　　参与控制肿瘤细胞的增殖，死亡，转移和细胞周期进程。发现Ras诱导的AKT活化突变导致H1.5T10ph下调，但对H1.5表达没有影响。Ras-AKT活化能够抑制苏氨酸10中H1.5的磷酸化。H1.5T10ph被发现参与由Ras-AKT激活驱动的A172细胞生长和迁移，表明H1。5T10ph作为肿瘤抑制因子。

　　这些因素也是肿瘤中的关键调节因子。CYR61，IGFBP3，WNT16B和NT5E是癌基因，而GDF15和CARD16被认为是肿瘤抑制因子。在不同的实体瘤中，CYR61被证明可以促进肿瘤生长和血管形成以及细胞侵袭和转移Cyr61参与前列腺癌细胞的生长，迁移和转移。CYR61通过IGF1RB依赖的EMT样过程触发骨肉瘤转移性扩散。

　　WNT16B的过表达促进肿瘤生长和化疗耐药治疗诱导的WNT16B分泌促进肿瘤生长并获得对化学疗法的抗性：对癌症治疗中潜在使用抑制剂的影响。IGFBP3的消耗通过IGFBP3消耗抑制肿瘤生长作为胶质瘤中的潜在治疗。NT5E抑制抑制肾细胞癌中舒尼替尼抗性细胞和EMT过程以及AKT信号传导途径的生长。诱导的肿瘤细胞的损失，并由此抑制了肿瘤细胞的生长。

　　体外和体内实验表明GDF15的过表达。EZH2介导的GDF15表观遗传抑制预示着预后不良并调节非小细胞肺癌的细胞增殖。寡聚化的CARD16促进胱天蛋白酶-1组装和IL-1B加工。抑制肿瘤细胞通过分别控制胱天蛋白酶和细胞增殖，生长。H1.5T10ph能够调节这些基因的转录，进一步证实了H1.5T10ph参与胶质瘤的进展。

　　GSK3是一种多功能Ser激酶，可磷酸化糖原合成酶。较近的文章证明，GSK3不仅参与糖原代谢的调节，而且在与细胞迁移，增殖和存活密切相关的各种信号通路中发挥核心作用。迷迭香酸衍生物对糖原合成酶激酶-3B的抑制是阿尔茨海默病中Kangen-Karyu的药理学基础。提示GSK3负责在苏氨酸10中磷酸化H1.5由GSK-3在苏氨酸10处的组蛋白H1.5的M期特异性磷酸化。

　　Ras-AKT信号通过降解GSK3抑制H1.5T10ph。已经将GSK3与Ras信号传导联系起来。GSK3是Ras降解所必需的，这个过程是通过蛋白酶体介导的B-连环蛋白-RAS相互作用通过GSK3B作为RAS降解的分子开关。GSK3对Ras介导的肿瘤存活至关重要l。GSK3抑制上调B-连环蛋白和c-Myc以消除KRas依赖性肿瘤。Ras-AKT信号转导降解GSK3以促进胶质瘤细胞的生长和迁移。

　　MDM2是遍在蛋白-蛋白质连接酶，其作为肿瘤抑制蛋白p53的调节剂起作用。它被称为控制蛋白酶体介导的降解的酶MDM2E3连接酶活性的乙酰化依赖性调节决定了其致癌功能。发现Ras-AKT激活在蛋白酶体抑制剂MG132存在下不抑制GSK3表达，Ras-AKT信号通过蛋白酶体依赖性方式降解GSK3。通过MDM2通过Ras-AKT活化降解GSK3。

　　考虑到Ras在人类癌症的发病和进展中的重要性，已经开发出针对Ras的临床试验。几种直接靶向Ras的药物正处于II期和III期试验中，如替比法尼。大多数人已被确认没有效果针对癌症治疗中的RAS信号传导途径。影响Ras下游信号传导的药物的临床用法。

　　例如，temsirolimus和依维莫司，用于抑制PI3K信号传导的药物。靶向癌症中的PI3K信号传导。依维莫司和来曲唑在复发性雌激素受体阳性高级别卵巢癌中的2期试验。目前正在试验中。更好地了解Ras-AKT信号传导将有助于抗肿瘤药物的开发。

　　发现Ras-AKT信号传导的致癌功能可能是通过抑制H1.5磷酸化。Ras-PI3K-AKT信号通过下调H3K56ac表达促进葡萄膜黑色素瘤的发生和发展。致癌基因磷脂酰肌醇3-激酶信号传导靶向赖氨酸56处的组蛋白H3乙酰化。建议的Ras-AKT信号通过调节组蛋白修饰工作。本文提供了Ras的致癌功能的可能解释。并且这些发现有利于在临床中利用药物靶向这种信号传导。

　　Ras-AKT信号通过抑制苏氨酸10中H1.5的磷酸化来驱动胶质瘤细胞的生长和迁移。Ras-AKT激活通过MDM2依赖性GSK3降解抑制H1.5T10ph。

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