蛋白对抑制神经胶质瘤的影响

　　胶质瘤是男性和女性中较常见和较具破坏性的脑癌，也是导致癌症相关死亡的第二个常见原因。虽然治疗策略发展迅速，但恶性神经胶质瘤患者的预后仍然很差。遗传变异已经在许多方面得到了解决，但迫切需要考虑如何利用这些发现来设定新的治疗目标。河马路在细胞增殖、器官大小控制、组织再生和肿瘤发生中起着关键作用。转录共活化剂和PDZ河马路径的关键下游效应是结合基序。

　　在细胞中，可以激活河马信号，然后磷酸化TAZ。去磷酸化的TAZ从易位到细胞核TEAD，TAZ复合物在细胞核的关键部分相互作用，作为转录共同激活因子，用于调节一大群基因表达，这与细胞凋亡、增殖和移民有关。Hippo引起激活的途径TAZ由此产生的磷酸化TAZ多泛素化并通过F-box蛋白B-TrCP依赖性降解。

　　TAZ与肿瘤增殖和转移正相关。神经胶质瘤，TAZ恶性神经胶质瘤的间充质特征可以通过与许多间充质基因的相互作用来促进。结局不佳的多形胶质母细胞瘤患者总是表现出高水平TAZ表达。TAZ通过减少替莫唑胺引起的细胞凋亡，增强了通常用于治疗神经胶质瘤的替莫唑胺的耐药性。TAZ它在神经胶质瘤细胞的侵袭性表型中起着至关重要的作用。产生截短蛋白，可以表达截短蛋白TAZ的TEAD结合结构域；并确定其在体内和体外的抗肿瘤活性，以充分解决抑制问题TAZ-功能和机制。TAZBD对恶性神经胶质瘤TEAD复合装配。

　　胶质瘤组织是从医院神经外科研究中获得的，包括7个低度星形细胞瘤、19个间变性星形细胞瘤和12个胶质母细胞瘤。在所有病例中，神经胶质瘤的诊断都通过组织学得到了证实。免疫组织的化学使用如前文所述。切片用二甲苯和乙醇进行脱蜡和脱水，然后使用0.5％H2O2.阻断内源性过氧化物酶的处理。为了进行免疫组织化学分析，切片被用于TAZ抗体染色并进行评估。两位独立病理学家对强度和程度的染色进行评分。

　　将U251和U在这里，87细胞含有10%的胎牛血清Dulbecco改良Eagle5%培养基CO2下于37℃培养。通过扩展编码TAZTEAD结合域的DNA片段生成TAZBD。慢病毒TAZ和TAZBD包装在HanbioBiotechnology中，并在U251和U进一步稳定地表达87细胞。整个裂解在放射免疫沉淀测量缓冲液中U251和U87细胞，定量蛋白质浓度。用蛋白琼脂糖珠对裂解液进行预处理1小时，然后用抗蛋白琼脂糖珠预处理1小时FlagM2或抗TAZ抗体孵化过夜。

　　10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离沉淀物，并准备用于蛋白质印记。裂解和定量细胞，然后准备SDS-PAGE和转移。封闭膜并用识别Flag，TEAD，TAZ或B-actin探测一抗。通过增强化学发光法相应选择第二抗体进行检测。用Kodak一维图像分析软件定量指示条的强度，并将其标准化为B-肌动蛋白。

　　通过流式细胞术或末端脱氧核苷酸转移酶dUTP神经胶质瘤细胞的凋亡是通过标记缺口末端的染色来确定的。AnnexinV用于检测细胞凋亡率的阳性和碘化丙啶。通过测量伤口愈合来确定迁移能力。细胞生长在60毫米细胞培养板中。细胞达到90%汇合后，刮除单层膜，用200%uL移液器吸头形成伤口。刮伤后24小时，用显微镜对伤口进行成像。细胞迁移能力由下式决定：0小时无细胞视野-24小时无细胞视野。

　　通过transwell测量细胞侵袭能力。在上室接种10个细胞，并使用200L无FBS的DMEM培养。五百微升10%FBS在低室中加入培养基。处理后24小时，10%使用滤膜上的细胞Giemsa染色，用显微镜计算。用U87和U251细胞聚集形成播种细胞并计数菌落。准备了四到六周龄的无胸腺小鼠。收如前面提到的，收集U251，U251载体或U251-TAZBD细胞并将其注入裸鼠左侧。

　　因为升高的TAZ它与人类癌症的恶性临床病理字符有关，用于评估TAZ人脑胶质瘤在肿瘤进展中的状态及其作用，首先在10对胶质瘤组织及相邻正常组织中确定TAZ表达。TAZ信使RNA分别通过蛋白通过qPCR和Western确定印迹测定法。与正常组织相比，TAZ主要表现在神经胶质瘤组织中。高级别肿瘤mRNA蛋白质水平显示得更高TAZ表达。与7个低级别星形细胞瘤相比，在回顾性队列的31个高级别神经胶质瘤组织中也观察到了高水平TAZ。

　　差异具有统计意义。TAZ在神经胶质瘤中TAZ肿瘤恶性肿瘤正相关。由于TAZ‐TEAD建议阻断复合物在肿瘤发生中的关键作用TAZ‐TEAD复合物的形成可的形成TAZ依赖性肿瘤的进展。因此，建立了一个表达式TAZ的TEAD结合结构域的截短物，并确定其抗肿瘤活性。与亲本或空载体转染的细胞相比TAZBD表达稳定U251和U细胞表现出低菌落形成能力。TAZBD表达也减少了U251和U细胞生长率87。

　　此外，进行TUNEL神经胶质瘤细胞的凋亡是通过染色和流式细胞来确定的。TAZBD表达导致在TUNEL阳性细胞图的数量显著增加，也导致抗凋亡率增加。U251和U87细胞中存在TAZ时BCL-2，BCL-XL和survivin表达都减少了。TAZBD神经胶质瘤细胞阻断神经胶质瘤细胞凋亡来阻断神经胶质瘤细胞的增殖。

　　还通过U通过皮下神经胶质瘤模型确定了251细胞TAZBD抗肿瘤活动。小鼠TAZBD表示细胞显示肿瘤发展缓慢，肿瘤显示减少PCNA与IHC确定阳性率。因此，TAZBD神经胶质瘤细胞的生长在体外和体内受到抑制。

　　因为TAZ通过促进癌细胞的增殖和癌基因的转移来促进癌基因的增殖。接下来，研究人员确定了这个角色TAZBD调节肿瘤转移的神经胶质瘤细胞。与Transwell与分析法测定的对照细胞相比，过度表达UAZ和U87的TAZBD细胞显示袭能力降低。TAZBD入侵细胞的过表达细胞数量明显减少。为了证实TAZBD通过伤口愈合试验来确定受调节的细胞迁移能力TAZBD是否会影响神经胶质瘤细胞的迁移。

　　TAZBD表达后，U251和U细胞迁移明显减少。TAZBD神经胶质瘤细胞的侵袭行为可以通过阻断细胞转移来减少。因为上皮间质转化是肿瘤迁移的关键步骤，所以存在TAZBD在这种情况下，进一步确定EMT相关的基因表达。观察上皮标记E-钙与蛋白质的诱导和间充质标记波形蛋白和N-减少钙粘蛋白。TAZBD表达也减少了Twist和Snail的表达，Twist和Snail是启动EMT两个关键转录因子。因此，TAZBD通过抑制神经胶质瘤细胞中的表达式EMT抑制肿瘤转移的特点。

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