胶质瘤侵袭迁移标志物靶向控制研究

　　胶质瘤侵袭迁移标志物靶向控制研究，胶质瘤的侵袭迁移过程受多种信号转导通路的调控，是一种复杂的相互作用网络。针对肿瘤细胞信号转导通路上的特异分子进行靶向治疗，是目前胶质瘤研究的热点，而且越来越多的研究更为关注侵袭迁移相关通路的靶向控制。

　　1针对细胞运动相关蛋白的靶向控制

　　细胞运动能力是胶质瘤细胞侵袭迁移的基础，细胞运动涉及多种蛋白质分子及信号转导通路，如从参与细胞骨架组装的肌动蛋白相关蛋白2/3复合物（Arp2/3）、皮质肌动蛋白（Cortactin）、LIM激酶1（LIMK1）到Abelson2（ABL2，又称Arg）及Rho家族蛋白（Rac1、RhoA）等。胶质瘤细胞前端片状伪足的形成在细胞运动过程中起着至关重要的作用，其中，Arp2/3能够定位于肌动蛋白丝的侧面，从而诱导肌动蛋白分支的形成，随着肌动蛋白分支的延长，与其相对应的细胞质膜即形成片状伪足，在不同级别胶质瘤患者的脑组织切片中均有Arp2/3表达，随着胶质瘤恶性程度的增加，Arp2/3表达水平亦逐渐升高。Arp2/3特异性控制剂CK666可使胶质瘤细胞伪足结构消失，并控制其运动和侵袭迁移能力。

　　Cortactin是丝状肌动蛋白（F-actin）结合蛋白，可调控Arp2/3复合体的激活，在肌动蛋白相关运动中扮演重要角色，与Arp2/3相似，Cortactin表达水平与胶质瘤的病理级别呈正相关（P=0.000）并与Arp2/3共同定位于胶质瘤细胞伪足，降低胶质瘤细胞系中Cortactin表达水平，控制胶质瘤伪足的形成和侵袭迁移能力。作为细胞运动下游通路的重要分子，即Rho家族中的Rac1，主要发挥分子开关功能并调控一系列细胞运动，可通过激活丝切蛋白（Cofilin）阻断肌动蛋白微丝末端的帽蛋白，而调控肌动蛋白骨架的重组；同时还可调控LIMK1的磷酸化，LIMK1通过磷酸化和失活Cofilin而参与对F-actin细胞骨架动力学的调节。

　　虽然，LIMK1对Cofilin切割F-actin具有控制作用，但细胞运动是F-actin被切割和组装交替进行的过程，也是F-actin动态重组的过程。因此，控制胶质瘤细胞LIMK1的表达亦可以控制其伪足的形成和侵袭迁移能力。ABL2/Arg非受体酪氨酸激酶主要参与Arp2/3与Cortactin复合体的形成，同时将上游的磷酸分子传递至Cortactin，参与F-actin的切割与重组，胶质瘤细胞系中的沉默ABL2基因具有控制其侵袭迁移的能力，而胶质瘤侵袭性伪足同样是介导胶质瘤侵袭行为的重要因素。ABL2参与胶质瘤细胞侵袭性伪足的形成，沉默ABL2基因控制下游Cortactin的磷酸化，进而阻碍胶质瘤细胞侵袭性伪足的形成。

　　2细胞运动形式的转换

　　单细胞的侵袭迁移方式包括间质运动和变形虫样运动，Rac1与RhoA信号转导通路之间具有相互拮抗的特点，间质运动和变形虫样运动随着这两种信号转导通路的拮抗相互转换，因此，控制上述信号转导通路即可诱导这两种运动形式的互相转换。本实验室通过对三维水凝胶胶质瘤侵袭模型的观察发现，Rac1控制剂NSC23766可使胶质瘤细胞发生间质-变形虫样运动转换（MAT），由于变形虫样运动速度较快，与空白对照组相比，经NSC23766处理过的胶质瘤细胞的运动距离和运动速度均增加；Rho相关蛋白激酶1（ROCK1）是RhoA的主要下游效应子，而在ROCK1控制剂Y-27632的作用下，胶质瘤细胞则可发生变形虫样-间质运动转换（AMT），由于间质运动呈慢运动方式，与空白对照组和NSC23766处理组相比，Y-27632处理组胶质瘤细胞的运动距离和运动速度同时降低，而NSC23766和Y-27632联合应用组胶质瘤细胞无论运动距离还是运动速度均明显降低。

　　基于三维水凝胶胶质瘤侵袭模型构建的胶质瘤细胞侵袭迁移模型，以调控单细胞运动的关键分子Rac1和RhoA为靶向，控制Rac1信号转导通路，使胶质瘤细胞发生间质-变形虫样运动转换，而控制RhoA信号转导通路时，胶质瘤细胞则出现变形虫样-间质运动转换，表明单独控制间质运动或变形虫样运动中的一种运动方式，无法改变胶质瘤细胞侵袭迁移的特性，唯有同时控制上述两种运动方式，才能合适降低胶质瘤细胞的侵袭迁移能力，提示Rac1与RhoA联合靶向治疗可作为控制胶质瘤播散的策略。

　　3离子通道与酸碱微环境

　　细胞内各类离子通道均参与机体的多种病理生理学过程。其中，钙离子信号转导通道异常与恶性肿瘤细胞侵袭迁移行为密切相关，主要是通过影响钙调蛋白（CaM）、富含脯氨酸的酪氨酸激酶2（Pyk2）、S-100蛋白（S-100）家族等下游相关蛋白的生物活性，而调控细胞黏着斑的周转、细胞骨架的重构等肿瘤细胞运动等相关环节。有研究显示，由钙池调控的钙离子内流（SOCE）参与胶质瘤细胞的侵袭迁移，而钙离子释放所激活的钙离子信号转导通道蛋白1（Orail1）和基质相互作用分子（STIM1）对SOCE具有协同调控作用；Orail1在高级别胶质瘤细胞中呈高表达，SKF96365或敲低Orail1表达水平可以控制胶质瘤细胞系的侵袭迁移能力。此外，Pyk2磷酸化有促进胶质瘤黏着斑周转的作用；而Orail1可通过上调Pyk2磷酸化水平，促进胶质瘤黏着斑的周转，同时还可促进胶质瘤细胞的上皮间质转化（EMT），从而加强胶质瘤细胞的迁移运动。

　　CaM和S-100A4蛋白同属钙结合蛋白，拥有EF-手型结合域，可以与钙离子相结合而激活下游的蛋白激酶和离子通道，敲低S-100A4表达水平，控制胶质瘤细胞的侵袭迁移能力。在胶质瘤细胞运动过程中，CaM可在表皮生长因子（EGF）的诱导下出核，与细胞质中侵袭性伪足相关蛋白钠氢反转运蛋白1（NHE1）和Src蛋白相结合并使其激活，诱发侵袭性伪足形成和肿瘤细胞侵袭迁移。此外，由细胞外酸化和细胞内碱化所致的细胞内外pH值梯度反转是肿瘤代谢微环境的重要特征之一，NHE1广泛存在于各种细胞膜上，是调节细胞内外酸碱平衡和细胞体积的重要蛋白质。

　　CD44是由细胞膜表达的糖蛋白，其胞外域可作为胞外骨桥蛋白、透明质酸的受体，是影响胶质瘤细胞侵袭迁移能力的重要监测指标之一；酸性微环境可使CD44表达水平升高，促进胶质瘤细胞的侵袭迁移。钠钾氯共转运体1（NKCC1）在恶性胶质瘤中呈高表达，与胶质瘤的恶性程度密切相关，可调节胶质瘤细胞体积的大小，在NKCC1的作用下胶质瘤细胞体积缩小，易穿过狭窄的细胞外间隙向远隔部位迁移播散。此外，NKCC1尚可调节肿瘤细胞骨架，在促进胶质瘤细胞体积转换的同时，可以通过激活Rac1和RhoA，从而诱发上皮间质转化，加强胶质瘤细胞的侵袭迁移能力。

　　4SDF-1/CXCR4介导的趋化运动

　　趋化因子是一类具有促炎症趋化性的小分子细胞因子，与其受体结合后可诱发免疫反应、稳定内环境、促进血管生成、增强细胞黏附，以及干细胞存活。趋化因子CXCL12亦称为SDF-1，其受体为CXCR4，随着胶质瘤恶性程度的增加二者表达水平亦逐渐升高。组织病理学研究显示，在肿瘤中心的血管内皮细胞和坏死区域周围的细胞均可见表达阳性的SDF-1，CXCR4则主要表达于血管周围细胞和坏死区周围细胞，坏死区周围细胞SDF-1和CXCR4表达水平升高，提示缺氧可能是微环境SDF-1和CXCR4表达升高的原因。

　　在胶质母细胞瘤微环境中，SDF-1可与胶质瘤细胞表达的CXCR4结合，从而提高胶质瘤细胞MMP-9分泌水平、增强胶质母细胞侵袭性。此外，在SDF-1的诱导下，还可促进胶质瘤细胞Rac1的激活，并诱导Rac1聚集于细胞运动前缘胞膜下，促进伪足的形成。位于细胞核前120°扇形范围内的高尔基体对肿瘤细胞的运动方向具有指向作用，尽管体内微环境复杂，细胞运动方向杂乱，但是在肿瘤组织坏死区周围组织中，大多数胶质瘤细胞的高尔基体均位于细胞核背向坏死区一侧，而在坏死区以远的肿瘤组织中，高尔基体杂乱无章，无规律排列，证实由非坏死非缺氧区血管内皮细胞分泌的SDF-1，可诱导在缺氧微环境中高表达CXCR4的肿瘤细胞逃离缺氧坏死区。

　　5靶向胶质瘤干细胞侵袭

　　迁移胶质瘤干细胞（GSCs）被认为是一群具有自我更新、无限增殖、多向分化能力的肿瘤细胞，决定胶质瘤的侵袭性及对放射治疗和药物化疗的抵抗性，而向胶质瘤周围组织侵袭和迁移的干细胞也被认为是术后复发的“种子细胞”。胶质瘤干细胞中的CD133+细胞高表达Rac1，且表达水平高于CD133-细胞，而Rac1控制剂可控制胶质瘤干细胞的侵袭和迁移能力。此外，在胶质瘤干细胞维持其表型的过程中，Notch1信号转导通路活化为关键环节；基因沉默Notch1表达或通过Notch1通路控制剂控制其活性，不仅可以使磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）通路活性降低，而且胶质瘤干细胞的侵袭迁移能力亦明显下降，表明Notch1通路活化后需经PI3K通路调节胶质瘤干细胞的迁移和侵袭。

　　本实验室研究结果显示，Notch1通路对于胶质瘤干细胞自我更新和侵袭迁移的调控是通过SDF-1/CXCR4轴实现的，Notch1和CXCR4均聚集表达于胶质母细胞瘤干细胞球的外缘，并且与干性标志物CD133、巢蛋白（Nes）、少突胶质细胞转录因子-2（Oligo-2）以及性别决定区Y盒-2（SOX2）共表达于胶质瘤干细胞；Notch1通路通过激活SDF-1/CXCR4轴，进而激活丝氨酸/苏氨酸激酶（AKT）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号转导通路，较终实现对胶质瘤干细胞侵袭迁移的调控。

　　6表观遗传分子开关

　　肿瘤细胞的增殖与其运动密切相关。早在1996年即有学者提出了肿瘤细胞的“goorgrow”假说：当肿瘤细胞所处的局部微生态环境不利于肿瘤细胞增殖时，肿瘤细胞会迁移至适宜其生存和增殖的环境，并在适宜的微环境中进行增殖与迁移表型转换，启动相应生物学变化。肿瘤细胞的运动与增殖表型转换不仅受外部因素的影响，而且在细胞增殖和细胞运动两种表型复杂的分子和信号转导通路调控之间，其细胞内还同时存在一个调控表观遗传的开关。研究表明，在进行迁移运动的胶质瘤细胞中微小RNA-451（miRNA-451）表达水平明显下调，后者主要发挥调节肝激酶B1（LKB1）/腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）信号转导通路作用，可使胶质瘤细胞在不同葡萄糖环境中分别表现为增殖表型或迁移运动表型。

　　miRNA-451可增强胶质母细胞瘤哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1（mTORC1）活性、控制AMPK和Rac1被激活，进而实现胶质瘤细胞增殖-迁移表型的转换；与之相对，若在缺氧、低能量等微环境中，胶质瘤细胞miRNA-451呈低表达，则将促进AMPK发生磷酸化，进一步激活Rac1，从而使胶质瘤细胞获得更强的迁移能力，进而逃离这种不利于生长的微环境，发生远隔部位转移。