在分子生物学和先进基因组学时代，我们对人类脑肿瘤的理解已取得明显进展。与其他癌症研究领域相比，神经肿瘤学领域面临着诸多挑战，进展较慢，包括克服血脑屏障、脑肿瘤位置导致无法全切除、复杂的脑肿瘤微环境以及缺乏可靠的临床前模型等。为此无数科学家将精力投入到开发新的靶向药物上，而研究的主力对象就是小鼠。
它们在识别新的治疗靶点和评估新疗法方面发挥了重要作用，但仍然存在一些技术局限和大量成本投入，为了快速推进临床前研究，几十年来科学家逐渐将目光放在非哺乳动物身上，如黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）、秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）和斑马鱼（Danio rerio），它们成为小鼠的替代品。近年来，科学家已经在它们身上发现了新的基因、治疗靶点以及用于高通量遗传和化学操作的技术。
与小鼠相比，这三个物种寿命更短，资源消耗更少，适合进行高通量药物和RNA干扰筛选，针对新靶点测试大量有前景的药物。Rutka教授领导的The Arthur and Sonia Labatt 脑肿瘤研究中心在这方面取得了突出成果。Rutka教授认为，利用这些强大的筛选工具和策略，可以加速癌症研究领域，特别是神经肿瘤学领域的发现。
01
PART
黑腹果蝇：
脑瘤模型与靶向药物
果蝇与人类之间的遗传相似性高达75%，人类疾病相关基因在果蝇基因组中存在同源物。果蝇中枢神经系统包含六种类型的胶质细胞，它们与哺乳动物共享发育和功能特征。
果蝇的生命周期一般只有10天
（1）胶质瘤
由于人类与果蝇的磷脂酰肌醇3-激酶和表皮生长因子受体的同源物之间高度保守，科学家开发了repoGal4-胶质细胞特异性组成型活化、过表达的PI3K/EGFR模型。该模型重现了增殖和紊乱的生长信号传导，导致双侧叶和腹神经索的肿瘤性胶质细胞，最早在发育的第一龄期即可检测到。过表达PTEN诱导激酶1并定位于胶质细胞的果蝇与对照组相比表现出减少的增殖表型，表明PINK1作为胶质瘤生长抑制因子的新作用。
B-Raf原癌基因的激活遗传改变在低级别胶质瘤中很常见，因此Rutka教授通过在胶质细胞中表达组成型活化的Raf，生成了一个BRAF果蝇低级别胶质瘤模型。FGFR-TACC基因融合在人类癌症中频繁出现，并在3%的GBM病例中发现。Rutka教授通过将患者来源的FGFR3-TACC3在胶质细胞中表达，生成了一个果蝇模型，发现所有肿瘤都会发展出组织硬化，这是人类胶质瘤的一个物理标志，机械敏感性离子通道Piezo增加了肿瘤组织的硬度和增殖。
果蝇也被用于模拟胶质细胞迁移和侵袭。通过分别过表达PDGFR/VEGFR、FGFR1和胰岛素受体基因的同源物Pvr、htl和Inr，能够在果蝇脑中模拟增加的迁移性和肿瘤性胶质细胞。
（2）髓母细胞瘤
目前果蝇中的髓母细胞瘤模型使用转基因品系，这些品系在诸如音猬因子和WNT等通路中诱导异常的胚胎发育。这些转基因果蝇被用于功能丧失或功能获得筛选、表观遗传学发现以及大数据集生物信息学分析。
果蝇在脑肿瘤研究中的实用价值。
(A)展示了一对果蝇(雄性与雌性)在异源染色体1X染色体上的交叉情况，其中突变隐性等位基因w(白眼)与显性野生型等位基因W(红眼)并存。呈现出孟德尔遗传现象。F代表后代中显性和隐性性连锁等位基因的比率保持1:1的比例，由此产生50%为杂合子、50%为单倍体隐性个体的结果。
(B)简化的转基因交叉过程，涉及一种组织特异性Gal4表达构建体与位于目标基因上游的UAS表达构建体之间的结合。在F中，子代Gal4结合并激活JAS增强子，以转录下游基因。感兴趣基因的表达将反映Gal4在特定组织中的表达情况。
(C)药物/小分子筛选平台。(i)早期第一龄幼虫被置于96孔板中，其中幼虫食物与感兴趣的化合物混合。(i)幼虫在72-96小时内消耗药物-食物混合物，随后进入第三龄后期阶段。(ii)第三龄后期的幼虫进行中枢神经系统提取。(iv)体积分析/药物反应可通过显微镜进行评估。
(D)未转化的共聚焦显微镜图像(上方和代表野生型果蝇中枢神经系统的示意图(下方)，使用了荧光UAS-红色荧光蛋白报告基因。
(E)经转化的转基因(DP110CAAX和dEGFR)胶质瘤模型，由共聚焦显微镜成像(上方)，并附有示意图(下方)。注意脑部肥大及腹侧神经节反映出果蝇胶质细胞的高增殖状态。
02
PART
秀丽隐杆线虫：
脑瘤模型与靶向药物
1998年，秀丽隐杆线虫成为第一个基因组完全测序的后生动物，其中约52.6%的人类蛋白质编码基因在线虫中具有已知直系同源物，预计40–75%的人类疾病基因在线虫基因组中具有同源物。许多生物过程，如细胞信号传导、凋亡、细胞极性、代谢和衰老，在人类和线虫之间是保守的。
线虫的生命周期包括胚胎发生期、由四个幼虫阶段（约3天）组成的胚后发育期、成虫期
线虫缺乏类似脊椎动物的复杂分节大脑。它的神经系统由一束神经元和胶质细胞组成，头部仅有58个神经元。线虫中不存在传统意义上的脑肿瘤模型，但可以对保守的驱动通路进行建模，以研究其对癌症不同标志的影响。
在线虫中，Ras/丝裂原活化蛋白激酶通路在调节细胞增殖、分化和各种细胞命运决定中发挥作用。胰岛素样生长因子-1依赖性的MAPK级联激活诱导外阴发育并产生过度增殖的多外阴表型。敲除daf-2基因可以抑制let-60功能获得突变的Muv表型，以及let-60(gf)突变体生殖细胞中辐射诱导凋亡的超敏反应。daf-18负调控MAPK信号以控制外阴发育以及线虫中的神经母细胞分裂。这些通路在线虫中的高度功能保守性为利用这种生物强大的遗传学来理解Ras和PTEN如何协同控制细胞命运决定的机制提供了机会。
在胶质母细胞瘤中，约40–50%的原发性病例发生PTEN缺失，而受体酪氨酸激酶/Ras/PI3K通路在88%的所有胶质瘤中被激活。在线虫中，Ras信号通路调控外阴细胞特化。Ras信号活性增加会导致外阴前体细胞命运的异位诱导，从而产生Muv表型56。Rutka教授的实验室已生成了一个let-60 (KRAS); daf-18 (PTEN)双突变胶质瘤模型，该模型将let-60(gf)的Muv表型增强至接近100%。还引入了一个cdh-3::GFP转基因（在外阴中表达）56进入daf-18(lf)和let-60(gf)双突变株系，以便通过荧光显微镜轻松区分Muv表型。激活的let-60(KRAS)与daf-18(PTEN)缺失的组合提供了一个遗传上易于处理的动物模型，用于研究胶质瘤中最常改变的信号通路之间的协同作用。
已经在各种线虫突变体中进行了广泛的RNAi筛选，这些筛选产生了大量功能数据，有助于理解更复杂生物体中的详细基因功能。Rutka教授的实验室对daf-18(lf); let-60(gf)双突变体进行了全基因组siRNA筛选，发现了几个能强力抑制其Muv表型的基因。这些靶点不仅具有人类直系同源物，而且在GBM中也失调，这表明了使用线虫识别潜在治疗靶点的实用性。
线虫也可用于小分子发现。涉及靶点验证的药物筛选可以通过基于琼脂的测定法进行，使用活体线虫来观察形态或运动。可以使用药物喷雾器或微孔板读数器进行高通量药物筛选，这两种方法均可使用活体或固定的线虫。在复杂且昂贵的脊椎动物模型系统中测试候选药物之前，线虫是药物发现管道中一个经济且快速的系统。
线虫在脑肿瘤研究中的应用。
(A、B) 线虫中KRAS与PTEN (let-60;daf-18) 的双重突变会导致一种表现出近乎100%显性的多裂生殖表型的菌株。
(C)KRAS;PTEN双突变菌株还在阴道细胞以及神经系统内表达cdh-3:GFP报告基因。
(D)RNAi筛选实验方案。首先，表达针对线虫中每个特定基因的dsRNA的不同E.coli菌株在过夜培养基中生长，随后被诱导以激活dsRNA的表达，接着被培养在24孔琼脂固体培养板上。约30条L1线虫被接种到每个培养孔中，每个孔内都含有表达不同dsRNA的E.coli菌株。待线虫发育至成虫阶段后，便对其表型进行分析，以考察其对多阴门表型的抑制作用。
03
PART
斑马鱼：
脑瘤模型与靶向药物
斑马鱼是一种小型热带水生物种，与人类享有相当的遗传同源性。约71.4%的人类基因至少有一个斑马鱼直系同源物，82%与人类疾病相关的基因在斑马鱼中存在对应物。主要器官在发育和功能上与人类相当。胶质细胞和神经发育的机制及其功能高度保守。这凸显了它们在模拟人类脑肿瘤方面的潜力。
（A）斑马鱼的生命周期包含四个主要阶段：胚胎、幼体、未成年和成年阶段。(B)脑肿瘤异种移植模型高通量药物筛选工作流程示意图。
在过去十几年中，斑马鱼已成为模拟人类脑瘤的有效系统。由于斑马鱼胚胎和幼虫的透明性质，可以实时监测肿瘤以评估肿瘤细胞浸润和微环境，这是胶质瘤生物学的关键方面。在斑马鱼中模拟中枢神经系统肿瘤的另一个重要考虑因素是血脑屏障的完整性，这对药物测试方法至关重要。
通过利用ptf1驱动的活化AKT，在斑马鱼中小脑特异性胶质瘤发生是可能的。随后发现Rb的体细胞失活导致斑马鱼小脑中产生类似髓母细胞瘤的肿瘤，这些肿瘤被归类为原始神经外胚层肿瘤。使用这些模型，MAPK/ERK激酶抑制剂U0126被确定为与KRAS过表达相关的异常表型的抑制剂，揭示了一个用于筛选Ras信号抑制剂（在胶质瘤及其他领域）的新型化学平台。未来，利用斑马鱼转基因和突变模型来探索内源性肿瘤微环境中的肿瘤起始、克隆扩增和侵袭将会很有趣。
将人类脑肿瘤细胞移植到斑马鱼中是一种简单有效的策略，可直接观察肿瘤细胞植入、生长和转移。产生的肿瘤重现了主要的表型和组织学标志，包括多形性细胞形态、高有丝分裂率和新生血管形成。在小鼠中看到的转移潜能在一部分鱼中得以保留，为体内研究转移驱动因素提供了一个新颖的高通量平台。GBM患者来源的异种移植物已在斑马鱼宿主中得到表征。类似的模型已被用于常用化疗药物的高通量测试，以辨别参与耐药性和转移的因素。已识别出一种名为TNB的新型含氮DNA交联小分子化学物质，它能穿过血脑屏障并抑制异种移植物的建立。体外鉴定的靶点（如MutT同源物1抑制）的验证可以在斑马鱼PDX模型中进行体内验证。
室管膜瘤和脉络丛癌的异种移植模型也已使用斑马鱼生成。斑马鱼中的异种移植方法揭示了与啮齿动物中所见相似的保守肿瘤细胞动力学，未来可以利用这些方法进行大规模的体内药物筛选。
人类基因在果蝇、线虫和斑马鱼等生物中具有高度的进化保守性，再加上它们先进的正向和反向遗传学方法，现在比以往任何时候都更容易构建像癌症这样多基因疾病的有意义的模型。线虫、果蝇和斑马鱼提供了快速可靠的筛选工具，用于探测和查询各种人类脑肿瘤的潜在遗传改变，并且可以作为强大的药物开发管道。重要的是，将这些动物改造成携带多个癌症相关突变以通过筛选方法识别遗传脆弱性是经济且快速的，而这些筛选方法可以在更准确地模拟人类脑癌的小鼠模型中进行验证。
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