胶质瘤液体活检的应用

　　胶质瘤检查——液体活检

　　它具有非侵入性、敏感性高、检测速度快的优点，降低了病理诊断的潜在危害，使临床医生能够尽快发现肿瘤。此外，我们通过分析和利用液体活检技术反复提取肿瘤样本的定期检查结果，然后调整治疗方案。目前，液体活检技术主要包括细胞外泌体检测、CTDNA检测、CTC检测、抗原检测和自身抗体检测。胶质瘤液体活检的技术和较新进展如下：

　　外泌体检测——胶质瘤液体活检

　　外泌体是起源于活细胞内吞的多泡体，直径约30~100nm，透气性强，易于到达体液，为外泌体检测提供了可能。不同的外泌体携带不同的分子，具有不同的生物功能。外泌体含有DNA.mRNA或microRNA。通过对这些物质的分析，可以得出原发肿瘤的性质，从而形成肿瘤的早期诊断。

　　胶质瘤细胞的外泌体更容易通过受损的血脑屏障进入血液，但即使在一些血脑屏障完好的胶质瘤患者的血液中，也能检测到胶质瘤细胞的外泌体。相关研究分别从这两种胶质瘤患者的外泌体中检测到了胶质瘤细胞的重要生物标志:IDH1G395A。利用全基因组测序法检测外泌体中的DNA，发现外泌体中的DNA全基因组与肿瘤细胞的全基因组高度一致。大多数外泌体中的MRNA具有稳定性差、易降解的特点，而外泌体中的MICRNA具有含量高、稳定性高的特点。因此，外泌体中的MICRNA具有更大的诊断价值，这在胶质瘤、乳腺癌等肿瘤的诊断中得到了证实。

　　鉴于外泌体种类繁多，我们需要找到可靠的方法来分离所需的外泌体。由于外泌体保留遗传信息的具体过程尚不清楚，胶质瘤细胞分泌的哪种外泌体对其具有较高的早期诊断价值，因此我们需要继续深入研究。多形胶质母细胞瘤(glioblastomamultiforme、GBM)肿瘤细胞外泌体中的miRNA特征部分可以反映其来源肿瘤的表型，miRNA可以判断和评估患者的预后。研究发现，亚特异性miRNA图谱可用于评估生存期。根据TCGA数据库的回顾性分析，miR-130a和TMZ的疗效呈正相关，不受MGMT甲基化状态的影响，但检测准确率有待提高。目前，研究发现，当外泌体通过血液循环到达腹水和胸膜积液时，检测标本更容易获得，从而提高了检测的灵敏度和特异性。

　　检测循环肿瘤细胞(CTC)——胶质瘤液体活检

　　循环肿瘤细胞是指从实体瘤原发灶或转移灶脱落后进入外周循环系统的肿瘤细胞。近年来，研究发现CTC是入侵的基础，起着诱导胶质瘤复发的作用，保留了原发肿瘤的特性。根据这一特点，CTC检测有助于尽快发现胶质瘤的入侵现象，判断患者的预后，因此备受关注。1955年，Engell证实了循环血液中CTC的存在。现在的研究表明，循环血液中的CTC具有生存能力强、入侵能力高的特点。它们经常通过聚集来入侵微环境。因此，通过分析循环血液中CTC的检测结果，可以对肿瘤进行早期诊断和评估。目前，端粒酶测定技术已用于检测。端粒酶测定法在11例胶质瘤患者血液中检测到8例CTC，约占73%，其中5例CTC数量较高，检测到CTC的效果也可以反映放疗效果。通过预后评估和跟踪，发现放疗后对CTC敏感患者的影响明显下降。

　　目前，该技术的缺点是人体循环体液量大，处于不断更新的状态，导致循环体液中CTC含量小。一些研究表明，只有检测到105~107个单核细胞，才能检测到1个CTC；另一个缺点是CTC的研究仅限于小样本的研究。为了应用于临床实践，需要对多样本进行大规模的深入研究。过去认为由于血脑屏障的存在，胶质瘤患者体内没有CTC。但近年来，通过对脑脊液(CSF)的CTC检测，发现脑脊液(CSF)的CTC检测具有独特的优势，因为CSF的来源仅限于中枢神经系统，与其他器官和体液没有交叉，检测背景干净，噪音低，使得通过脑脊液检测CTC进行胶质瘤的早期诊断具有很强的特点。

　　ctDNA检测——胶质瘤液体活检

　　血液循环中有一种DNA，叫做血浆游离DNA(cel-freDNA，cfDNA)，它处于无细胞结构和游离状态。循环肿瘤DNA(circulatingtumorDNA，ctDNA)是指肿瘤细胞释放到周围微环境中的一种遗传物质，因为ctDNA是cfDNA中的一种，所以目前提取ctDNA主要是从血浆中进行的。在胶质瘤早期，5×107个胶质瘤细胞在血液中产生的ctDNA数量可以满足胶质瘤早期诊断的检测要求，但这种数量级的胶质瘤细胞团在影像学上不易被发现，因此胶质瘤可以通过不断检测血液中的ctDNA数量进行早期诊断。由于胶质瘤在时间和空间上具有异质性特征，因此我们需定期检测ctDNA并分析其结果，以不断地对患者进行不同的治疗，从而避免延误改变治疗方案的时机。通过对ctDNA的定性和定量分析，有利于后续治疗。

　　然而，CTDNA检测仍然有其局限性：一方面，由于循环血液中CTDNA数量少，容易被CFDNA覆盖；其次，肿瘤的定位不能通过CTDNA的结果分析来实现，细胞功能也不能通过结果分析来研究；再次，CTDNA的检测结果没有统一的标准。

　　自身抗体检测——胶质瘤液体活检

　　自身抗体是指由自身免疫系统产生的一种对自身蛋白质、细胞、组织甚至器官进行早期诊断的抗体。研究发现，体内抗原可以放大免疫反应产生的生物信号，从而诱导针对肿瘤的自身抗体，从而在肿瘤抗原发现之前检测出抗肿瘤血清抗体，早于影像学诊断。在不同的肿瘤患者血清中发现了具有诊断价值的相应抗体，表明自身抗体可以作为肿瘤早期诊断的标志物。例如，抗p53抗体在30%~40%的肿瘤患者体内被检测到；Anexini和II的自身抗体在60%的肺腺癌和33%的肺鳞癌患者中被检测到；抗Mucin1(MUC1)。Rad51的自身抗体在胰腺癌患者体内被检测到。由于恶性肿瘤具有复杂性和异质性的特点，仅通过检测体内的相关抗体往往诊断肿瘤的灵敏度和特异性较低，因此通常采用各种自身抗体的早期诊断方法将其诊断提高到8%。胶质瘤是中枢神经系统中较常见的恶性肿瘤。如果能早期诊断，可以通过提高手术全切率来好转患者的预后。

　　目前，胶质瘤的诊断主要依赖于影像学，但价格昂贵，难以实现早期诊断。因此，有必要开发一种简单的胶质瘤早期血清诊断方法，但在胶质瘤患者的血清中，相应的自身抗体很少见，这可能是由于血脑屏障阻止胶质瘤细胞与免疫细胞接触引起的。P53基因有两种：野生型和突变型。野生P53基因产生的蛋白质稳定性较差，难以检测，突变P53基因产生的蛋白质稳定性应增加，从而通过免疫组化检测突变P53。研究发现，P53基因突变在脑胶质瘤中也起着重要作用。