BDNF信号加速恶性胶质瘤细胞死亡的研究

　　恶性神经胶质瘤是较常见的侵袭性癌症，起源于中枢神经系统的神经胶质细胞。尽管对胶质瘤进行了大量的研究，但只有一些有限的治疗方法来控制其进展。胶质瘤患者的中期存活时间为7至14.6个月，包括手术、放疗和化疗。脑源性神经营养因子是神经营养因子家族的成员，被认为在各种癌症中发挥着重要作用，包括神经母细胞瘤、乳腺癌、肿瘤细胞增殖、凋亡、侵袭和转移，以及骨髓瘤。

　　能抑制C6胶质瘤细胞凋亡率，改善细胞生长迁移。CREB参与细胞系统的增殖、分化和存活。CREB激活可导致CREB诱导转录和BDNF表达。与原肌球蛋白相关的激酶B是BDNF下游受体。它会触发许多信号级联，这对细胞生理活动至关重要。BDNF能激活TrkB通过三个主要的下游信号，包括PI3K信号。

　　磷脂酰肌醇激酶可使肌醇环3-OH基团磷酸化，并将相关信号蛋白募集到膜上，包括PDK1和Akt。13PI3K激活和抑制几个目标，导致细胞凋亡和增殖。糖原合成酶激酶是Akt下游，促进各种肿瘤的生长和化疗耐药性，包括胶质瘤和结肠癌。GSK-3B磷酸化的失活抑制了癌细胞的凋亡。提示BDNF信号可能在调节胶质瘤生长和细胞凋亡方面发挥重要作用。

　　AG1601是AG一系列抗胶质瘤药物，并在原有的基础上进行了改进。AG1601的相对分子质量远小于其他分子质量AG一系列药物，如AG1031。如之前的研究报告，AG1031和AG1503对C6胶质瘤细胞凋亡有积极作用。AG1031已被FDA批准并承诺治疗神经胶质瘤。AG一系列抗癌药物显示了癌症的潜在治疗效果。AG1601是较新的AG一系列抗癌药物可能很有希望用于治疗胶质瘤。研究AG1601能抑制生长并诱导生长吗C6胶质瘤细胞凋亡及其潜在机制。

　　固定在立体定位支架上的10uL显微注射器向右侧纹状注射大鼠C6.神经胶质瘤细胞。用戊巴比妥腹膜麻醉，将大鼠放在立体定位仪中。去除头骨上的头发后，中间的一个小切口由头皮轻轻制成。植入坐标如下：直至中线3-3.5mm，前囟后0.5mm和硬脑膜下5mm深度。在坐标处钻一个1毫米的小孔。

　　C6胶质瘤细胞为1uL以每分钟的速度注射到纹状体中。注射后，将针停留约10分钟，以避免回流。轻轻取出针头，用骨蜡密封孔，缝合切口。手术后，将大鼠放入笼子中，自由获得食物和水，直至从麻醉中恢复。假手术组大鼠大脑注射等量DMEM。

　　手术后将大鼠分为四组：羞耻组；羞耻组；+AG1601组；胶质瘤组；羞耻；+AG1601组。每天静脉注射神经胶质瘤大鼠一次，持续7天。

　　使用RIAP裂解缓冲液提取C6细胞和组织的蛋白质。用PBS洗两次细胞。用RIPA缓冲液在冰上裂解细胞和组织0.5小时。通过在12000rmp总蛋白质离心15分钟。定量收集上清液，通过定量收集上清液BCA蛋白质测定试剂盒检测蛋白质浓度。等量蛋白质负荷通过10%SDS-PAGE凝胶在恒定的120V下电泳约90分钟。将凝胶在100V在冰水中转移90分钟到聚偏二氟乙烯膜上。

　　5%脱脂奶粉含5%吐温20Tris缓冲盐水中封闭膜1小时，在一抗中孵化，如抗体和试剂部分所述，在4小时内孵化℃过夜，然后洗一段时间。将膜与辣根过氧化物酶偶联的第二抗体以1:2000的浓度稀释1小时，然后用1:2000的浓度稀释1小时。

　　TBST再洗一段时间。蛋白质条带通过计算机化学发光成像系统成像。B-肌动蛋白用于内部对照。通过NHIImageJ软件确定条带的量化。通过NHIImageJ软件确定条带的量化。

　　注射AG1601周后，给所有动物注入0.1MPBS并用4%以上的聚甲醛固定。用15%和30%的蔗糖溶液梯度脱水。脱水后，将大脑置于-20℃的OCT在化合物中，切成10um。用苏木精和曙红染色脑切片。因此，肿瘤的形态可以在细胞水平观察。为检测肿瘤生长，进行检测Ki67免疫荧光。用PBS溶解的0.1％TritonX-100使切片透化，然后在PBS中洗涤3×10分钟。

　　将切片在PBS中的5％NGS中封1小时，4小时，℃在封闭溶液中稀释的抵抗力下Ki67中孵化过夜。在PBS中洗涤3×10分钟后，使用切片PBS以1：1000稀释的AlexaFluor488-第二抗体孵化1小时。所有荧光切片均为40x油物镜的LeicaTCSSP5激光扫描共聚焦显微镜成像。使用ImageJ分析图像荧光。神经胶质瘤细胞凋亡检测，进行神经胶质瘤细胞凋亡检测TUNEL分析。

　　固定和透化的切片和TUNEL混合物在室温下孵化1小时。用PBS洗三次后，将切片用于切片DAPI染色。凋亡细胞通过LeicaTCSSP405激光扫描共聚焦显微镜nm油物镜上在440nm处成像。

　　在C6细胞粘附在六孔板上的盖玻片后，使用六孔板上的盖玻片PBS根据胞三次，根据厂家的说明和20次ug每毫升碘化丙啶)一起温育30分钟。温育后，用它，用它。PBS将细胞洗三次，用4%以上的聚甲醛固定10分钟，再用三次PBS洗涤。取出盖玻片并将其连接到具有的具有KPL荧光固定介质的载玻片。Olympus荧光显微镜测定凋亡细胞。亮红色核被认为是细胞凋亡核。

　　AG1601是否影响C6细胞增殖。使用不同浓度的AG1601处理细胞12、24、48小时。MTT当浓度和时间增加时，C6细胞增殖减少。100、200和4000细胞增殖uM浓度显著降低。AG1601抑制了C6细胞增殖，具有时间和浓度依赖性。提示BDNF信号在调节各种肿瘤的增殖和凋亡中起着重要作用。AG1601处理后，进行了检查BDNF与信号相关的蛋白质。

　　研究人员发现BDNF作为BDNF信号激活剂，可逆转AG1601对C6细胞的抗增殖作用。PI染色还显示BNDF可降低AG1601诱导的C6细胞凋亡率，而K252a可增加AG1601引起的C6细胞凋亡率，这也说明了细胞凋亡率，AG1601与K252a联合可能被认为是治疗胶质瘤的潜在策略。AG1601还显着降低Bcl-xL表达，改进Bax表达水平。

　　BDNF激活AG1601诱导的BDNF抑制信号以抵抗细胞凋亡。K252a增加AG1601引起的C6细胞凋亡。这些都表明BDNF信号在调节AG1601对C6细胞在抗增殖和促凋亡中起着重要作用。为了验证研究人员的体外研究结果和测试AG1601对胶质瘤治疗的疗效，在Sprague-Dawley颅内建立在大鼠中C6胶质瘤动物模型，并采用胶质瘤动物模型，AG1601给药。

　　静脉应用于第二周AG1601年后，将神经胶质瘤大鼠的脑肿瘤剥离，拍照，测量并立即称重。胶质瘤大鼠的物理发现如下：在胶质瘤生长过程中，一些动物在胶质瘤生长阶段表现出异常的身体症状，包括显著的减肥、鼻出血、眼睛和嘴巴、驼背姿势和行动能力丧失。与神经胶质瘤组相比，AG1601抑制肿瘤，显著减轻肿瘤的大小和重量，整个治疗过程中没有毒性假期和假手术的迹象+AG1601组体重稳定增长所描述的时期。

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