鉴定髓母细胞瘤耐药途径的功能基因组学方法

　　髓母细胞瘤是小儿较常见的恶性脑瘤。尽管我们对髓母细胞瘤的认识不断进步，但对其病因和治疗仍有疑问。髓母细胞瘤在人口学、临床和分子上分为四个不同的亚组，分别称为WNT、SHH、Group3和Group4，并进一步分为其他不同的分子亚型。虽然（WNT）通路驱动的髓母细胞瘤患者预后良好，但其他亚型的复发率较高，如SHH，易局部复发，3组和4组与远端转移相关。转移性髓母细胞瘤的生物学特性不同于原发性髓母细胞瘤，可能代表一种不同的治疗疾病。在髓母细胞瘤的原发区和转移区，需要寻找治疗耐药的途径，以指导靶向治疗的选择。例如，SHH和3组髓母细胞瘤中MET原癌基因上调，可通过小分子控制剂Foretinib治疗细胞和小鼠模型作为靶点。我们利用睡美人突变转座子系统驱动的髓母细胞瘤自发性转移小鼠模型，在原发性和转移性髓母细胞瘤中找出对福雷替尼耐药的功能驱动因素和途径。这是一种同时解剖多个肿瘤部位的治疗耐药模式的新方法，可以很容易地应用于其他癌症系统。

　　方法

　　一个髓母细胞瘤突变小鼠模型（Ptch+/-，SB100/SB68，T2Onc），自发地发展为原发性和转移性髓母细胞瘤，外显率为全切，被用来确定Foretinib耐药性的途径（图1a）。这个系统允许癌基因和抑癌基因的截留，这可以通过转座子插入位点的下一代测序来确定。我们先前的研究表明，在SHH和3组髓母细胞瘤小鼠模型中，Foretinib是MET通路的合适控制剂（图1b）。在30-35天的时间范围内建立肿瘤后，小鼠通过连续渗透泵以每小时0.25μl的速率输注脑脊液28天，用赋形剂或Foretinib治疗（图1a）。获取耐药的原发性和转移性肿瘤，通过SPLINK-PCR结合配对末端Illumina高通量测序（图1a）鉴定基因组共同插入位点（gCIS），以确定治疗耐药的基因驱动因素。

　　A.转座子诱变系统在髓母细胞瘤中鉴定介导福替尼耐药的基因。描述用福替尼治疗带髓母细胞瘤小鼠的步骤和转座子插入位点的鉴定。B.一个Kaplan-Meier图显示接受福替尼治疗的小鼠总生存期好转

　　结果与讨论

　　我们利用睡美人转座子系统来识别对福替尼的耐药性通路，作为概念验证策略，这可以应用于其他癌症模型和系统。在原发性成神经管细胞瘤中，福替尼治疗小鼠的gCISs模式与对照组小鼠高度不同，从而支持原发性成神经管细胞瘤的潜在机制与接受福替尼治疗的肿瘤不同。在原发性foretinib治疗的肿瘤中，我们发现了Pten、Cdh2、Egfr和Acvr1b等已知肿瘤致癌基因和肿瘤控制基因的特异性插入。举两个例子，PTEN插入被评估为失活突变，其位置和反义定位在基因的5 '端，引入一个早期的多聚A转录终止信号。CDH2插入可以促进CDH2小亚型的表达和/或控制该基因长亚型的表达。与癌症数据库中的体细胞突变目录相比，这些候选基因中的大多数已被证明在癌症中发生了突变，其中一些先前与脑肿瘤发生有关。此外，在原发部位肿瘤中介导foretinib耐药的机制被涉及蛋白代谢的途径，特别是泛素介导的蛋白降解的途径所代表(图(Fig.2d).2d)。我们的研究结果表明，患有成神经管细胞瘤并接受福替尼治疗的小鼠表现出与原发性病变不同的通路改变。这些通路是通过睡美人转座子插入分析确定的，代表了福替尼耐药成神经管细胞瘤的候选驱动因子和潜在靶点。

　　历史上，转移性疾病被认为与原发性肿瘤高度相似，因此对针对原发性病变的治疗也同样合适。利用睡美人转座子系统，我们发现原发性和转移性髓母细胞瘤表现出不同的遗传改变模式（图3a，附加文件1：表S1-S4）。在原发性髓母细胞瘤中鉴定的gCISs包括转录调节因子，如Crebbp和Ep300，以及转移性髓母细胞瘤免疫应答相关基因，如C6、A2m和Pkp2（附加文件1：表S5-S8）。这些数据支持髓母细胞瘤的原发区和转移区是由不同的分子机制驱动的[12]。接下来，我们询问转移性髓母细胞瘤与原发性治疗肿瘤相比，是否会进化出不同或趋同的耐药途径。我们发现，与载体治疗的小鼠相比，接受Foretinib治疗的转移性髓母细胞瘤表现出不同的基因组插入模式（图3b）。此外，转移性gCISs与同样接受福雷替尼治疗的小鼠的原发性室高度不同（图3c）。Foretinib耐药的转移性髓母细胞瘤包括Basp1、Flt4、Mllt10和Asxl2（图3d、e）3d、e）和参与细胞代谢的途径（图3f）。这些发现表明原发性和转移性髓母细胞瘤在分子上是不同的，因此它们对治疗的反应和抵抗力可能有很大的差异。此外，我们证明了功能基因组作图的合适性，以同时确定在不同的肿瘤隔间肿瘤发生的假定驱动因素。

　　结论

　　我们的研究已经确定了髓母细胞瘤细胞可能参与克服Foretinib控制的潜在途径，并为其他髓母细胞瘤靶向治疗的耐药途径的确定提供了策略。这些途径的前瞻性鉴定可用于确定对耐药原发性和转移性肿瘤克隆合适的联合治疗。在我们的模型中，我们进一步证明了原发性和转移性髓母细胞瘤在基因上是不同的，并且在对Foretinib治疗的反应中，表现出不同的耐药机制。我们的方法的一个局限性是，虽然可以确定驱动途径，但它们可能并不代表耐药人类原发性肿瘤的确切靶向基因。因此，使用这种睡美人方法结合耐药原发性肿瘤的基因组特征进行综合功能性小鼠建模，可能会优先考虑介导癌症治疗耐药的途径和特定靶点。较后，我们的数据支持针对原发部位基因靶点的治疗可能对转移性病变无效，并且在治疗的原发性和转移性髓母细胞瘤之间可能发生不同的基因进化。