对于活检目标的选择，最理想的方法是利用相同的穿刺方法分别对增强和非增强区域进行活检组织，但在实际操作中难以实现。一般来说，颅内病变活检优先考虑增强部分，但DIPG增强较少。如果增强部分位于脑干腹侧或靠近神经核团，则在增强区域选择靶点可能会增加并发症的发生率。Puget认为目标可以选择在MRIT2（或Flair）等高信号区域，或通过脑桥臂取出脑桥的后三分之一。脑干病变活检主要包括月经穿刺和枕下小脑穿刺。月经通道一般用于中脑和脑桥上部病变，小脑通道主要用于脑桥下部和延髓病变。
儿童脑干胶质瘤活检：选择活检靶点和穿刺方法。研究表明，靶点的准确性与穿刺轨迹的长度成反比，经额轨迹的平均长度为(85.9±4.7)mm，MRI靶点偏差为(2.2±1.18)mm，而平均长度为(59.5±4.1)mm的经小脑轨迹，靶点偏差仅为(1.81±0.7)mm。但后来的研究表明，经额途径可以提供与经小脑途径相同的诊断率和安全性，这两种途径在诊断率和并发症发生率上没有显著差异。经额途径较长，可提供相对平行的穿刺轨迹，但扩大的脑室可能限制穿刺路径的设计。
Chen和其他人认为，当一侧的月经量有限时，可以通过另一侧的穿刺来避免穿破脑室引起的出血或脑组织漂移的风险。小脑通道较短，通过脑桥臂穿刺的神经结构较少。无论选择哪种穿刺方式，都应尽量避免脑室、血管、小脑幕等结构。
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