长非编码促进胶质瘤细胞的研究

　　胶质瘤被认为是中枢神经系统中较常见、较恶性的脑肿瘤，复发率高，死亡率高。其中，胶质母细胞瘤被认为是较具侵袭性的亚型，5年生存率不超过5%。根据其组织病理特征，鉴于恶性程度，胶质瘤可分为低级胶质瘤和高级胶质瘤。目前，手术切除、局部照射、常规化疗等多种治疗方法取得了很大进展，诊断两年后胶质瘤患者的死亡率仍然很高。

　　为了在胶质瘤的进展中找到有用的诊断标志物和复杂的基因相互作用和分子调节网络，人们也做出了较大的努力。然而，该机制仍处于起步阶段，更好地了解参与胶质瘤形成和发展的分子机制对突出潜在的治疗目标和寻求胶质瘤治疗策略具有重要意义。

　　已证明长非编码RNA细胞增殖、迁移、的细胞过程，如细胞增殖、迁移、入侵和凋亡。越来越多的证据暗示lncRNA不同类型的肿瘤常发现并导致肿瘤进展和侵袭。阿霉素诱导的胶质瘤细胞坏死lncRNATUG1被下调lncRNAH19的下降控制了G胶质瘤细胞的致瘤性和干性。lncRNAMT1JP簇位于16号染色体上，由金属硫蛋白家族中的一些同源蛋白编码基因组成。

　　MT1JP还注释了几个基因座CpG岛、单核苷酸多态性，以及DNase超敏感位点簇已确定MT1JP它似乎在控制肿瘤中起着重要的作用，这表明它在控制肿瘤中起着重要的作用MT1JP与肿瘤组织中相比，相应的正常组织表现较低。MT1JP神经胶质瘤的作用仍有待揭示。磷酸酶和张力同源物被称为肿瘤控制因子，其表现在一些人类肿瘤中被降低。

　　PI3K信号传导是调节肿瘤发生的一种方式，在神经胶质瘤中活化。在此基础上，海外医疗网络的研究人员通过调整进行了这项研究PTEN研究了信号通路lncRNAMT1JP在胶质瘤细胞生物学性质中的作用。

　　人神经胶质瘤细胞系U87，U251和SNB19购自美国培养保存中心。神经胶质瘤细胞系统。U87，U251和SNB19含有10%新生小牛血清Dulbecco改良的Eagle在37个培训基础上进行培训℃下培养5小时CO2培养箱。对数生长期的细胞用于后续实验。

　　MT1JP表达质粒和MT1JP干扰质粒。选择Neo作为MT1JP克隆载体干扰质粒。用QIAGEN质粒提取试剂盒提取MT1JP表达质粒和MT1JP干扰质粒。通过NanoDropND-2000检测DNA纯度和浓度：当纯度被认为满足时OD质粒可用于260范围内的要求。在转染前的一天，胶质瘤细胞在不含抗生素的培养基上铺设在6cm培养皿中。细胞密度在16小时后通过显微镜观察到80-90。

　　在转染当天，将MT1JP表达质粒、干扰质粒和相应的阴性对照质粒加入500种不含抗生素和血清的质粒ul培养基中。将Lipofectamine2000和比例为1:1的质粒加入500ul充分混合无血清和无抗生素的培养基。在室温下分解混合物5分钟。将含有MT1JP过表达质粒，MT1JP干扰质粒a，d脂质体转染试剂的混合物混合孵化。神经胶质瘤细胞被分配到空白组。

　　收集转染细胞制备单细胞悬浮液。将细胞密度调节到5×每毫升104细胞，并将细胞接种到96孔板中，每组配备6个平行孔。在培养箱中预先培养培养板，然后将培养板加入每个无光的孔中CCK-8溶液。将培养板在37℃孵化3小时，用酶联免疫吸附测定波长450nm吸光度值。细胞活力是指含有CCK-8溶液、细胞但无药物溶液孔的吸光值；A代表含有CCK-8溶液，培养但无细胞孔的吸光值；A对应于含有CCK-8溶液、细胞和药物溶液孔的吸光值。

　　重复实验一式三份。根据1×将细胞接种到六孔培养板中。细胞粘附后，细胞同步培养12小时，去除原始培养基，相应处理一段时间。分离细胞后，通过离心收集细胞，将细胞与预冷75%乙醇重悬浮在-20℃下固定过夜。离心后放弃上清液。每个样品中使用450ul磷酸盐缓冲盐水悬浮细胞，再加入50个ul碘化丙锭，然后在37℃将水浴放置30分钟。离心后再次弃去上清液。通过流式细胞仪测量和分析细胞周期分布。

　　将转染细胞补充到预冷1x结合缓冲液。向细胞悬浮液中加入5ul膜联蛋白-V-FITC和2.5ulPI并轻轻混合。通过流式细胞仪检测细胞凋亡。在散点图中，左下象限显示健康活细胞，右下象限显示早期凋亡细胞，右上象限显示坏死和晚期凋亡细胞。凋亡率=早期凋亡百分比+晚期凋亡百分比。实验独自重复三次。

　　转染48小时后，细胞在无血清中DMEM培养基饥饿12小时。将细胞浓度调整到12小时×每毫升10个细胞，并在每个入侵室中添加100个细胞ul细胞悬浮液。每个入侵室的基底外侧室补充60%的胎牛血清60%ulDMEM对Transwell入侵测定，基质胶在无血清中DMEM培养基被稀释到细胞在室内接种的前一天晚上。Trasnwell迁移试验中没有补充基质胶。

　　5%的室在CO37培养箱温育℃接下来，迁移试验在入侵试验28小时后持续20小时。用90%乙醇固定房间，00%乙醇固定.1%晶体紫溶液染色并在显微镜下观察。在光学显微镜下显微镜下随机拍摄，以计算细胞总数。

　　六孔板的背面垂直于水平轴，每00个.5-1.0cm用标记物标记间隔。将基于对数生长期24小时无血清处理的细胞接种到6孔板中，基于5孔板×10个细胞孔的数量。当细胞达到90%时，用垂直于板的枪头沿标记线划伤细胞。PBS清洗细胞两次，以洗去划伤的漂浮细胞。将其添加到细胞中McCoy's5a培养基并置于5%中CO37培养箱在37℃。照片在倒置显微镜下拍摄0到24小时。

　　愈合面积采用图像工具软件计算，计算为初始划痕的宽度值×全切。从细胞中提取总蛋白，用二辛可宁蛋白浓度测量试剂盒，确定蛋白质浓度，调整每组蛋白质浓度。细胞通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离转移，加入5%脱脂奶粉，加入4%℃下密封过夜。

　　50只6周龄雌性BALB无胸腺裸鼠。随机分为五组：空白组，pEGFP-NC组，pEGFP-MT1JP组，shRNA-NC组和pGPU6-MT1JP-shRNA分组。严格控制裸鼠的繁殖条件，温度恒定，环境中没有病原体。接种前将肿瘤抬高约一周。分离和转染后，每组细胞在10000中rpm离心5分钟洗两次。收集细胞，混合稀释的高浓度基质胶。总共5个×107通过皮下注射在裸鼠的左腋窝中注射细胞。每天给裸鼠注射细胞，观察裸鼠的生长情况，使裸鼠称重。光标卡尺测量肿瘤的大小。通过数据处理进行实验记录，描述肿瘤生长曲线。40天后，通过CO吸入使裸鼠安乐死，测量肿瘤体重和大小，估计肿瘤体积。

　　独自重复实验。测量数据表示为平均值和标准偏差。吨位试验用于分析组间的差异。单向方差分析用于分析三组或多组之间的差异。列举数据通过率或百分比，并表示χ试验用于分析。Kaplan-Meier方法获取患者的生存曲线，通过对数顺序获得不同表达水平患者的生存率差异。Cox回归评估临床参数的预后意义。双面分析用于全部分析，并在p小于0.05时观察到明显的差异。

　　用于测定神经胶质瘤组织和细胞中的定量逆转聚合酶链反应MT1JP表达方法。结果表明，在正常的脑组织中MT1JP比胶质瘤组织表达更高。还检测MT1JP在三个人类神经胶质瘤细胞系中发现U87，U251，和SNB19和MT1JP的较高表达SNB在19个细胞中发现，较低的是U87细胞。MT1JP表达与胶质瘤组织临床病理特征的关系。根据胶质瘤组织MT1JP胶质瘤患者的中位表达分为MT1JP高表达组和MT1JP低表达组。

　　结果提示MT1JP脑胶质瘤的表现WHO分级与生存时间有关系。肿瘤分布于年龄、性别、KPS肿瘤直径的评分和表达之间没有关联。通过Kaplan-Meier方法估计MT1JP表达与神经胶质瘤患者存活时间的关系。根据138名患者的生存曲线，MT1JP胶质瘤高表达患者的总生存时间明显长于胶质瘤患者MT1JP表达能力低的病人。

　　通过海外医疗网络的研究人员CCK-8测定进一步检测MT1JP对人脑胶质瘤细胞系U影响87增殖。MT1JP神经胶质瘤细胞的增殖能力在表达质粒转染后明显受到控制，MT1JP神经胶质瘤细胞的增殖能力在干扰质粒转染后提高。空白组，pEGFP-NC组和shRNA-NC组胶质瘤细胞增殖能力的差异没有统计意义。

　　结果表明，过度表达可以控制胶质瘤细胞的增殖，消除MT1JP基因能增强胶质瘤细胞的增殖活性。比较各组中神经胶质瘤细胞的周期变化。与空白组相比，pEGFP-NC组和shRNA-NC组细胞周期分布无差异；pEGFP-MT1JP组细胞周期分布发生变化，G0期细胞停滞，S期和G二期细胞停滞较少；pGPU6-MT1JP-shRNA在G0期停滞的细胞较少，S期和G二期细胞较多。

　　通过流式细胞术，每组神经胶质瘤细胞的细胞凋亡。与空白组相比，pEGFP-NC组和shRNA-NC细胞凋亡没有区别。pEGFP-MT1JP胶质瘤细胞凋亡率明显高于组pEGFP-NC组，pGPU6-MT1JP-shRNA细胞凋亡率低于shRNA-NC组。这些结果提示lncRNAMT1JP过度表达可以促进胶质瘤细胞的凋亡，胶质瘤细胞中MT1JP胶质瘤细胞的凋亡可以被基因敲除。通过Transwell通过六个不同视野的细胞数来检测每组神经胶质瘤细胞的侵袭性。

　　所述质粒pEGFP-NC和shRNA的-NC组。与pEGFP-NC组相比，pEGFP-MT1JP在这一组中，入侵细胞的数量入侵细胞的数量减少，pGPU6-MT1JP-shRNA入侵细胞数和shRNA-NC相比更高。这些结果表明lncRNAMT1JP胶质瘤细胞的过度表达可以控制胶质瘤细胞的入侵，胶质瘤细胞中的胶质瘤细胞MT1JP胶质瘤细胞促进胶质瘤细胞的侵袭。实施Transwell通过迁移来确定神经胶质瘤细胞的迁移能力。

　　pEGFP-NC组和shRNA-NC迁移细胞的数量没有差异。pEGFP-MT1JP迁移细胞数量低于pEGFP-NC组，pGPU6-MT1JP-shRNA迁移细胞的数量明显高于迁移细胞的数量shRNA-NC组。lncRNAMT1JP胶质瘤细胞的过度表达能控制胶质瘤细胞的迁移，胶质瘤细胞中的过度表达能控制胶质瘤细胞的迁移MT1JP基因敲除可促进胶质瘤细胞迁移。

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