胶质母细胞瘤的基因治疗：这种特别的基因治疗有哪些优缺点？

　　胶质母细胞瘤（GBM）是成人中最常见且最具破坏性的原发性脑肿瘤。尽管目前有多种治疗方式，如手术切除后辅以化疗和放疗，但中位生存期仅获得适度改善。GBM的频繁复发和侵袭性很可能是由于胶质瘤干细胞对常规治疗具有耐药性，迫切需要新颖的替代治疗策略。

　　分子生物学和基因技术的最新进展为GBM患者提供了有吸引力的新型治疗可能性。基因治疗被定义为一种旨在修饰细胞遗传组成以获得治疗效果的技术。迄今为止，用于治疗GBM的基因治疗已在临床前研究中显示出抗肿瘤功效，并在临床研究中显示出有前景的安全性。这种方法显然很有希望，但仍存在与转导效率、病毒递送、脑的病理反应和治疗效果相关的问题。肿瘤的发展和进展涉及众多基因的改变，因此已经提出了多种针对GBM的基因治疗方法。改良的病毒载体正在评估中，并且正在研究单独使用基因治疗或与其他治疗协同对抗GBM的潜在用途。

　　在Rutka教授的一篇综述中（由于篇幅较长，将分成4篇详细阐述），讨论了临床前和临床研究中用于治疗GBM的常用基因治疗方法，包括：前药/“自杀”基因治疗、溶瘤基因治疗、细胞因子介导的基因治疗、抑癌基因治疗。Rutka教授还回顾了当前基因治疗策略的原理和机制，以及每种方法的优缺点。

　　01

　　引言

　　高恶性程度急需新的疗法

　　胶质瘤是成人中最常见的原发性脑肿瘤。胶质母细胞瘤（GBM）是最具侵袭性和最难治愈的类型。目前的标准治疗包括最大安全手术切除，随后进行放疗和替莫唑胺（TMZ）化疗。尽管有报告显示，当使用辅助TMZ化疗时可获得两个月的生存优势，但中位生存期仍低于15个月，大多数病例在诊断后2年内死亡。GBM观察到的高死亡率是许多促成因素共同作用的结果，包括其侵袭性和浸润性表型使得根治性手术切除极为困难。此外，GBM通常对放疗和/或化疗耐药。化疗可能因无法有效将药物递送穿过血脑屏障（BBB）而失败。中枢神经系统在很大程度上也被视为免疫豁免部位，免受全身免疫反应的攻击。这对于全身免疫增强策略的有效性而言是一个劣势。

　　所有癌症都含有一小群具有干细胞样特性的细胞，称为癌症干细胞（CSCs）。CSC的概念已扩展到脑肿瘤，包括GBM，并且现在正被作为治疗靶点加以利用。胶质瘤干细胞（GSCs）能够不对称分裂，产生自我更新的GSCs和分化的子代细胞，这些子代细胞可以获得不同的表型，随后失去其多能特性。疾病进展和治疗后不可避免的复发很可能归因于GSCs，它们具有高度侵袭性，并且对放疗和化疗药物耐药。不幸的是，尽管手术和辅助放化疗（包括分子靶向方法）在治疗播散性恶性肿瘤方面取得了显著进展，但GBM的预后仍然不令人满意。迫切需要新颖且更有效的策略，真正的进展只能来自我们对这些肿瘤分子生物学理解的加深，以及杀伤肿瘤药物递送的新机制。

　　基因治疗可以被定义为通过将治疗性基因引入靶细胞或操纵疾病相关基因（例如消除活化的癌基因）来治疗疾病。由于对病毒与细胞相互作用机制的更好理解以及重组脱氧核糖核酸（DNA）技术的进步，现在可以利用肿瘤细胞特异性的遗传缺陷，并构建在肿瘤细胞中选择性复制的病毒株。迄今为止，基因治疗已应用于几种类型的癌症。作为最致命的癌症类型之一，GBM是基因治疗的理想靶点，因为目前的标准疗法效果甚微，而且GBM很少转移到身体其他部位。

　　首个针对胶质瘤的基因治疗临床试验发表于20世纪90年代。已经研究并使用了不同的方法作为将基因递送到靶细胞的载体，包括：病毒载体；细胞载体（神经干细胞、间充质干细胞或胚胎干细胞）以及使用纳米技术（纳米颗粒或阳离子脂质体）的合成载体。尽管干细胞作为载体最近才进入临床研究，但它们有望成为将基因治疗与其他类型治疗相结合的有吸引力的载体之一。迄今为止，唯一进入胶质瘤临床试验的合成载体是阳离子脂质体，它被用作小分子载体。尽管使用脂质体进行基因转移被认为是安全的，但由于基因转移效率有限，其使用并不频繁。

　　病毒载体被认为是体内基因转移所有基因递送方法中很有效的。目前，最常用的DNA递送载体是基因修饰的病毒或载体。有两种类型的病毒载体用于抗胶质瘤治疗。第一种使用复制缺陷型病毒，能够将基因转导到肿瘤细胞中，导致有害的细胞内效应；第二种使用溶瘤病毒，其中复制的病毒具有裂解周期，并选择性杀死肿瘤细胞。在所有病毒载体中，腺病毒（AV）、逆转录病毒、单纯疱疹病毒（HSV）和腺相关病毒（AAV）是目前癌症患者基因治疗中使用很广泛的递送载体。

　　针对GBM的基因治疗策略种类繁多。除了大量的载体及其各自的特征外，不同的转基因提供了引发抗肿瘤反应的不同方式。因此，基因治疗是治疗GBM的一个可行选择。在综述中，Rutka教授回顾了：

　　(i)用于对抗GBM的主要基因治疗方法，包括通过发现细胞因子介导的基因治疗和抑癌基因治疗；

　　(ii)载体设计的原理；

　　(iii)载体在肿瘤细胞中复制的机制；

　　(iv)讨论每种基因治疗的优缺点及未来方向。

　　02

　　多种基因治疗方法之

　　“自杀”基因治疗

　　“自杀”基因治疗

　　在临床前研究和临床试验中，针对恶性胶质瘤最常用的基因治疗策略是“自杀”基因治疗。“自杀”基因治疗是一种将病毒或细菌基因引入肿瘤细胞，从而将无毒化合物转化为能够诱导肿瘤细胞死亡的致死性活性分子的策略。该策略的一个关键因素是，该基因编码一种酶，可将前药转化为细胞毒性药物。该策略基于这样的证据：前药激活酶通常不存在于哺乳动物细胞中，或以低水平表达。因此靶向肿瘤的病毒载体对于将酶的表达限制在转导的肿瘤细胞中是必要的。在众多临床试验中，已经使用腺病毒、逆转录病毒或非病毒载体递送方法评估了几种自杀基因治疗。针对GBM研究最广泛的自杀基因治疗是单纯疱疹病毒1型胸苷激酶（HSV-TK）基因治疗和胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶（CD/5-FC）。

　　使用HSV-TK作为基因治疗的可能性最早由Moolten于1986年报道。HSV-TK可以催化核苷类似物（如更昔洛韦[GCV：一种2'-脱氧鸟苷的合成类似物]）的磷酸化，而核苷类似物是哺乳动物TK的不良底物。在全身给予无活性前药后，GCV被HSV-TK转化为一种名为GCV三磷酸的有毒代谢物，该代谢物被掺入活跃增殖细胞的DNA中（图1）。

　　GCV三磷酸随后阻断DNA复制并抑制细胞分裂。凋亡是HSV-TK/GCV基因治疗诱导细胞毒性的机制基础。HSV-TK基因治疗是细胞周期依赖性的。因此，该疗法的一个优点是它对仅被转导的活跃分裂细胞表现出选择性细胞毒性。另一个优点是所谓的旁观者效应，即毒性直接从受感染细胞转移到邻近的未感染细胞，从而增强治疗效果。可以解释这种效应的一个可能机制是，未转导的细胞通过缝隙连接被磷酸化的核苷类似物的扩散所杀死，这由细胞间接触促进。第二个可能的机制是磷酸化的核苷类似物在邻近细胞中积累，诱导未转导细胞凋亡。第三种机制可能涉及吞噬作用，即邻近的转导细胞因凋亡小泡形成而被吞噬。在此过程中，一些细胞成分可能与邻近细胞共享，从而导致凋亡信号的传递。

　　HSV-TK/GCV基因治疗在动物模型中显示出有希望的结果。这些结果促使临床医生研究HSV-TK/GCV基因治疗胶质母细胞瘤。多项I期和II期临床试验表明，HSV-TK/GCV基因治疗是一种相对安全的策略。然而，有一些证据表明，HSV-TK转导的细胞可能对前药产生耐药性，因此需要将“自杀”基因治疗与放化疗联合使用。Rainov进行了一项最大的随机III期临床试验，其中248名新诊断、既往未经治疗的GBM患者被随机分为对照组（手术切除和放疗）或基因治疗组（手术切除和放疗，并在术中辅以复制感受态逆转录病毒介导的HSV-TK/GCV基因治疗）。尽管该试验证明HSV-TK基因治疗是安全的，但两组之间的中位生存期和肿瘤进展没有差异。基于这些数据，逆转录病毒介导的HSV-TK基因治疗没有治疗获益。作者得出结论，可能需要改进治疗性基因的高效递送和分布策略。尽管在体外和体内取得了有希望的结果，但由于转染效率极低，逆转录病毒介导的HSV-TK基因治疗在临床试验中的抗肿瘤效果仍然不足。支持这一点的是，Sandmair等人报道了一项I期临床试验，该试验纳入21名诊断为原发性或复发性GBM的患者，结果显示腺病毒介导的HSV-TK/GCV基因治疗组的中位生存期显著长于逆转录病毒介导组。Germano等人也在I期试验中报告了复制缺陷型腺病毒介导的HSV-TK基因治疗的安全性，治疗组的平均生存期为112.3周，一名患者自诊断起存活长达248周。综合来看，这些试验表明，使用腺病毒递送HSV-TK基因可能比逆转录病毒载体更好。根据大鼠胶质瘤异种移植实验的结果，至少需要10%的转染效率才能获得肿瘤体积的显著减小。目前正在进行利用腺病毒递送“自杀”基因治疗胶质瘤的临床试验（表1）。

　　使用胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶（CD/5-FC）的“自杀”基因治疗是一种被广泛研究的抗胶质瘤基因治疗形式。CD是一种微生物或酵母酶，能够将有效的抗真菌药物5-FC转化为高毒性的抗癌化合物5-氟尿嘧啶（5-FU）。由于哺乳动物细胞中不存在CD，因此5-FC对人体的毒性极小。5-FU的毒性作用是通过将5-FU转化为5-FU三磷酸介导的，5-FU三磷酸在掺入RNA后会干扰RNA加工；以及转化为5-氟-2'-脱氧尿苷5'-单磷酸，后者不可逆地抑制胸苷酸合酶，并阻断DNA合成（图1）。

　　与HSV-TK基因治疗类似，凋亡是CD/5-FC基因治疗细胞毒性机制的基础。5-FU是一种小分子，可以在转导细胞和邻近细胞中扩散进出，从而产生显著的旁观者效应，这种效应不需要细胞间接触和功能性缝隙连接。与HSV-TK基因治疗相比，在结肠直肠异种移植肿瘤模型中观察到，仅4%的肿瘤细胞被转导时，CD/5-FC基因治疗显示出更大的抗肿瘤效果。Dong等人报道，携带CD基因的复制缺陷型腺病毒载体以及随后给予5-FC，可显著延长荷瘤大鼠的生存期。为了提高CD/5-FC基因治疗的疗效，已经进行了几次尝试。Adachi等人报道，第二种酶——尿嘧啶磷酸核糖转移酶（UPRT），在哺乳动物细胞中不存在，可直接将5-FU转化为5-氟尿苷单磷酸，从而在实验性恶性脑肿瘤中增强CD/5-FC基因治疗的细胞毒性，表明CD和UPRT基因的共表达具有协同抗肿瘤作用。此外，CD/5-FC和UPRT基因治疗的组合也在胶质瘤动物模型中增强了常规放疗的效果。通过使用编码具有更高亲和力的突变细菌CD基因的复制缺陷型腺病毒载体，进一步增强了细胞毒性。这种重组CD基因与5-FC联合使用时，在胶质瘤异种移植模型中显示出显著的肿瘤细胞杀伤和肿瘤生长抑制。第二代非裂解性逆转录病毒复制载体（Toca 511）证明了CD的稳定递送，在小鼠胶质瘤模型中导致显著的生存获益，且无治疗相关毒性。此外，观察到Toca 511与随后给予5-FC的组合与TMZ（GBM患者最常用的治疗药物）具有协同治疗功效，在携带TMZ敏感胶质瘤的小鼠中产生了生存优势。

　　一种新颖的“自杀”基因治疗方法涉及使用基因工程神经干细胞作为载体。神经干细胞具有持续增殖和分化为神经元或胶质细胞的能力。使用神经干细胞作为GBM治疗载体的最大优点之一是它们具有朝向肿瘤细胞的侵袭能力，即使在肿瘤附近注射也是如此。基因工程神经干细胞已被成功用于将CD和HSV/TK基因产物递送到GBM中。

　　CD/5-FC基因治疗已进入临床试验，使用Toca 511或基因修饰神经干细胞作为载体的方法目前正在复发性高级别胶质瘤患者中进行研究（表1）。另一种类型的干细胞载体是间充质干细胞。间充质干细胞是非造血、多能干细胞。与神经干细胞相比，间充质干细胞具有优势，因为它们容易从患者组织中获取，如骨髓、脂肪组织、肌肉组织和外周血。它们内在的迁移到损伤和炎症部位的能力使它们能够侵入肿瘤。由于这种强大的归巢行为，间充质细胞已被用作针对胶质瘤的基因治疗载体。一些“自杀”基因治疗已采用间充质干细胞作为载体，包括HSV/TK、CD，以及HSV/TK与连接蛋白43（connexin-43）联合使用以增强旁观者效应。