微流控技术在胶质瘤研究中的应用

　　1循环肿瘤细胞的富集与分离检测

　　循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTC）是指从原发肿瘤脱落到体液中并参与体内循环的肿瘤细胞，是肿瘤转移的重要途径。从体液中分离这些细胞可作为一种微创、多时间点的液体活组织检查，对早期诊断与病情评估有重要意义。

　　是脑胶质瘤，这类影像检查无法确诊、留取标本存在困难的颅内肿瘤，CTC检查可在较大水平上减少创伤并提供确诊依据。CTC在血液中浓度平均低于100/ml，且其分布较不均匀，很难以种群形式分离。微流控技术则可通过肿瘤细胞与其他细胞在物理学或免疫学方面的差异进行分离，具有低成本、高通量、高精度的优点。

　　微流控技术分离CTC的方案可分为抗体依赖和非抗体依赖两种。非抗体依赖常用方法有过滤、声波分选、介电泳分选等，单纯依赖细胞间物理学方面的差异，成本较低，并且可通过改变剪切力、流速等变量调整分离效率，实现分离的高度可控性。同时，能通过细胞在经过通道过程中的速度、形变等数据，评价细胞骨架刚性，反映肿瘤侵袭性。而抗体依赖则是通过肿瘤细胞特异的表面标志物，在通道内或磁珠表面附着相对应抗体，通过抗原-抗体结合对肿瘤细胞进行分离，具有更高精确度。

　　目前已有通过上述各种方法开展胶质瘤CTC相关研究，但相较于其他常见肿瘤疾病，胶质瘤病例CTC并未得到深入研究，这很大水平上是受血-脑屏障影响，限制胶质瘤细胞向外周循环迁移，影响CTC检出率。同时这也提醒我们，在胶质瘤有明显脑膜侵犯、血-脑屏障受到损害时，外周血中CTC含量可能会上升；在脑脊液这种与脑组织之间屏障相对薄弱的体液中，CTC含量也可能会较高，这为以后研究提供思路。

　　2胶质瘤分子诊断

　　肿瘤发生与发展伴随着基因改变，同一种类肿瘤，由于基因型不同，也会表现出不同特性，其治疗方案及预后也不同。胶质瘤常见与治疗相关的基因有MGMT、EGFR、TERT、IDH1等，瘤组织病理学检查是目前惟一诊断方法，但由于存在瘤内异质性，单片并不能反映肿瘤细胞间差异与肿瘤整体情况，诊断存在着不准确性，并可能对治疗决策产生影响，同时长周期、高成本、低效率等缺点也限制其发展。

　　微流控技术结合单细胞成像技术可好转胶质瘤分子诊断，通过高通量的微通道对单个细胞分析，可同时测量多个胶质瘤特异性标志物，具有成本低、检测量大、准确度高等优点，可应用于单个细胞EGFR、PTEN等表达水平检测。同时，在肿瘤细胞进入通道后所表现出来的细胞表型生物标志，如细胞形态、运动型、可收缩性等特异性改变，也体现出细胞病理状态，可被综合于诊断当中提升准确性，并能够反映肿瘤细胞侵袭性。

　　针对胶质瘤细胞所特有的核酸进行检测，比如MGMT等突变基因所转录出来的特异性mRNA，以及miR-221等在胶质瘤细胞中表达含量上升的microRNA，也已经证明可用于胶质瘤分子诊断，与传统PCR扩增相比，更加准确、快捷。是近年来推出的10×Genomics等生物信息新技术，均应用微流控技术，能够在较短时间内利用少量样本建立基因文库，对肿瘤异质性研究与准确治疗具有重要意义。

　　此外，近年研究火热的细胞外泌体被看作是信息传递的一种形式，其内常包含有RNA等遗传物质并被分泌到周围组织，可从体液中检测到，这为胶质瘤相关标志物检测提供新思路，其价值也被证实。

　　3胶质瘤细胞体外培养及侵袭性研究

　　肿瘤细胞所处的细胞外基质（extracellular matrix，ECM）对于其生长、侵袭、转移具有重要作用，如何在体外构建准确的ECM成为研究肿瘤发生发展的关键。ECM不仅包含细胞因子等化学刺激，细胞间作用及不同应力等物理刺激也是重要成分，然而传统体外细胞培养环境为简单2D环境，缺乏构成ECM的条件。利用微流控技术可构建出多因素整合的立体ECM模型，例如改变微通道管径以研究细胞间相互作用，控制氧气、糖含量模拟不同环境细胞的代谢，通过微通道形态改变流体剪切力等，这对于在脑组织这种不同结构中生长的胶质瘤影响大。

　　由于血-脑屏障存在，胶质瘤少发生转移，其恶性程度表现在肿瘤对周围脑组织的侵袭能力。在侵袭过程中，瘤细胞通过与ECM黏附，以及动态损害正常组织实现迁移，而ECM不单单是由各种蛋白与细胞因子构成的混合物，其与瘤细胞之间紧密的力学作用，以及与周围组织结合的坚硬程度，均会影响瘤细胞侵袭过程。

　　利用微流控技术可在3D环境中构建不同孔径、形态、强度的基质，可达到对瘤细胞与ECM之间较准确控制，真实模拟胶质瘤细胞在脑组织间的迁移过程。胶质瘤向周围侵袭过程中还伴随毛细血管增生，而由新生血管产生的血液流体动力学改变以及压力、营养、氧气梯度，均是刺激细胞迁移的重要因素。

　　传统培养环境无法模拟这种局域差异，微流控平台则可通过构建胶原或基质细胞微通道模拟瘤周间质的血流，通过改变液体流速模拟脑脊液流动变化，同时可通过使用缺氧诱导材料和构建气体微通道来达到氧气浓度梯度，为缺氧相关细胞行为提供较可靠的ECM。同时，胶质瘤形成的毛细血管周围常会出现小胶质细胞聚集，这种微流控平台的构建为研究肿瘤免疫与炎症反应提供条件。

　　4胶质瘤相关药物研究

　　药物对细胞的作用与ECM密不可分，而微流控技术所提供的体外细胞培养平台能够更好模拟肿瘤在人体内所处的真实环境，药物的渗透、代谢、效能可得到较真实评价。同时，脑组织中药物作用有其不同性，因为存在血-脑屏障，药物透过血-脑屏障后浓度变化，会影响药物作用效果，因此，体外胶质瘤化疗药物研究需要模拟血液-屏障-细胞间的层次关系。目前已有研究设计出基于微流控芯片的血-脑屏障模型，在构建屏障半通透性的同时，也模拟了血液流动的剪切力，更加真实反映药物渗透过程。

　　在肿瘤耐药性研究方面，以往一个耐药细胞系构建需要长时间培养和增加药物浓度，而微流控平台可通过设计不同药物浓度梯度的通道，快速诱导耐药细胞系。同时，除细胞种群数量外，微流控技术构建的3D培养环境可提供更多细胞信息，如形态、迁移、血-脑屏障及ECM改变等，为研究药理及耐药机制提供帮助。