胶质母细胞瘤治疗：DNA损伤修复与替莫唑胺耐药性

　　胶质母细胞瘤治疗：替莫唑胺属于烷化剂，口服生物利用度近乎100%，且易透过血脑屏障，为目前治疗GBM的一线化疗药物。替莫唑胺进入肿瘤细胞后其分解产物可导致DNA的甲基化，进而干扰细胞的DNA复制，造成DNA损伤，达到抑制肿瘤细胞增殖的目的。但是在GBM细胞中存在极强的DNA损伤修复系统和复杂的损伤修复机制，这些修复机制是介导GBM对替莫唑胺产生耐药的重要原因。

　　目前认为，替莫唑胺耐药是O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶（O6-methyl-guanine-DNA methytransferase，MGMT）、错配修复（mismatch repair，MMR）、碱基切除修复（base excision repair，BER）等DNA损伤修复系统以及自噬、肿瘤干细胞等共同作用的结果。而在GBM的DNA损伤修复方面，新近的研究主要集中于MGMT、MMR以及一些具有调控DNA损伤修复功能的基因方面。

　　1MGMT介导的GMB耐药

　　MGMT的主要作用是在替莫唑胺造成肿瘤细胞DNA损伤之前逆转替莫唑胺对DNA的甲基化作用，它可以直接从鸟嘌呤O6的位置上去除烷基基团，导致替莫唑胺治疗失效，而GMB细胞中MGMT表达相对稳定且较其他类型胶质瘤高。因此，阐明调控MGMT的关键分子和信号通路，成为替莫唑胺耐药领域的研究热点。

　　1MGMT阳性GBM与替莫唑胺耐药

　　MGMT启动子甲基化与MGMT基因的表达密切相关，MGMT启动子甲基化后可直接抑制MGMT基因的转录。Tezcan等发现，欧油菜叶提取物通过促进MGMT启动子甲基化，协同增加了GBM的替莫唑胺反应，提高了替莫唑胺敏感性；此外，欧油菜叶提取物还可能通过下调p53抑制GBM细胞，从而将替莫唑胺的作用机制从典型的诱导细胞凋亡转变为激活线粒体死亡通路或坏死。

　　此外，Yang等发现，沉默特异AT序列结合蛋白1基因也可以引起MGMT表达的下调和SLC22A18表达的上调，从而缓解GBM的替莫唑胺耐药，提示特异AT序列结合蛋白1基因对MGMT介导的替莫唑胺耐药具有重要意义。然而，MGMT启动子甲基化有时与MGMT表达水平并不一致，提示可能有新的基因表达调控机制存在。如Chen等报道了一个名为“K-M增强子”的增强子，它是一个具有调节MGMT表达功能的远端增强子，K-M增强子的激活可以“绕过”MGMT启动子甲基化，激活MGMT的转录。

　　这一发现有助于解释部分GMB细胞中MGMT启动子甲基化与其表达水平不一致的情况，还可以解释部分MGMT启动子甲基化较高的GMB患者预后仍较差的问题。因此，MGMT基因的表达调控不仅仅依赖于启动子甲基化修饰这一表观遗传学水平，一些基于MGMT基因的转录水平、转录后水平、翻译水平和翻译后水平的调控机制研究将有助于更好地回答MGMT基因对替莫唑胺治疗的影响。

　　2MGMT阴性GBM与替莫唑胺耐药

　　具有MGMT表达的GBM患者对替莫唑胺治疗具有先天的耐药性，但MGMT基因缺陷的GBM患者也不一定对替莫唑胺敏感。Yi等研究发现，经过持续的替莫唑胺治疗后，大多数最初对替莫唑胺敏感的MGMT阴性GBM患者也会产生替莫唑胺耐药；进一步研究发现，脱氢胆甾醇2（dehydrocholesterol2，DHC2）的表达是MGMT缺陷细胞获得替莫唑胺耐药性的关键调控分子，而且在复发性MGMT缺陷的替莫唑胺抵抗性GBM患者的肿瘤组织中DHC2表达显著增强。

　　其机制主要是持续的替莫唑胺治疗诱导了GBM的细胞骨架重排，继而诱发DHC2的表达；抑制DHC2的表达可以增强替莫唑胺诱导的DNA损伤，提高MGMT阴性的GBM细胞对替莫唑胺的敏感性，但该调控通路在MGMT阳性患者的GBM细胞中并不显著。此外，脱氢表雄酮可通过降低MGMT阴性GBM细胞的DNA损伤阻止替莫唑胺诱发的细胞凋亡，其主要机制是脱氢表雄酮激活LYN-蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/Akt）级联反应，促进Sp1（specificity protein1）磷酸化，磷酸化的Sp1定位于替莫唑胺损伤的DNA，进而阻止了进一步的DNA损伤，同时磷酸化的Sp1还能募集组蛋白去乙酰化酶来完成去乙酰化，去乙酰化的Sp1可以招募增殖细胞核抗原来减弱DNA损伤，降低替莫唑胺的毒性。

　　2MMR介导的替莫唑胺耐药

　　MMR作为DNA修复机制的一种，发生在DNA损伤后。MMR可以拮抗替莫唑胺对GBM细胞的损伤作用，修复发生损伤的DNA，导致GBM对替莫唑胺的敏感性降低。新近的研究发现，在进行DNA损伤修复的过程中存在不成功的MMR，这种不成功的MMR发挥与MMR截然相反的作用。

　　在替莫唑胺的甲基化靶点中，DNA的鸟嘌呤O6是极为关键的一个，鸟嘌呤的甲基化可以引起碱基错配，而在DNA复制时不成功的MMR可将新合成链中错配的胸腺嘧啶（O6-甲基鸟嘌呤-胸腺嘧啶）识别并切除，从而导致DNA双链缺口形成，随着DNA复制的进行DNA损伤不断积累，引起细胞周期停滞，启动细胞的凋亡，以此来增加替莫唑胺的敏感性；而MMR的功能缺失会导致错配修复无法进行，若O6-甲基鸟嘌呤-胸腺嘧啶的错配一直存在，则会引起更多的碱基错配，最终导致基因突变，GBM的进展加快，使得肿瘤细胞对替莫唑胺产生耐药。因此，无论是不成功的MMR还是MMR缺陷都使得GBM对替莫唑胺治疗产生耐药。

　　研究发现，对于MMR缺陷所致的替莫唑胺耐药的GBM，通过提高极样激酶1（polo-like kinase 1，PLK1）的表达可以抑制其生长。另外，Stritzelberger等发现，洛莫司汀也可克服由MMR缺陷所引起的替莫唑胺耐药，另外，当过量的O6-甲基鸟嘌呤导致MGMT饱和时，错配的碱基也会触发这种重复但不成功的MMR，进而诱导凋亡。而相较于MMR，BER是修复DNA碱基损伤的主要DNA修复途径，有研究发现，激活的C1q/肿瘤坏死因子相关蛋白8-松弛素/胰岛素样肽受体1-信号转导及转录激活因子3通路可以促进GBM细胞的BER，并导致对替莫唑胺的耐药。

　　3调控DNA修复的基因

　　替莫唑胺引起的DNA甲基化并不能直接触发GBM细胞的死亡，它需要在甲基化后通过DNA复制和MMR来积累DNA损伤，最终导致DNA双链断裂的形成，而在此过程中X线修复交叉互补基因3（X-ray repair cross complementing gene 3，XRCC3）起关键调控作用。在生理情况下，XRCC3对于维持基因组完整性和细胞的存活至关重要，而在高级别的胶质瘤中XRCC3表达水平升高，过表达的XRCC3可通过同源重组促进双链断裂的修复，继而保护GBM细胞免受替莫唑胺诱导的细胞死亡、凋亡和细胞周期抑制，直接参与替莫唑胺耐药的形成；XRCC3剔除后，替莫唑胺引起的双链断裂修复概率显著降低，GBM对替莫唑胺的敏感性大幅提升。

　　此外，α-地中海贫血/精神发育迟滞综合征（α-thalassemia mental retardation syndrome X-linked，ATRX）基因也可通过调节DNA的损伤修复来参与GBM的替莫唑胺耐药，ATRX基因剔除可抑制DNA的复制和损伤修复，进而抑制GBM的生长和侵袭，增加替莫唑胺治疗的敏感性。因此，ATRX基因的表达也是胶质瘤患者预后更好、生存时间更长的标志。ATRX基因发挥作用的具体机制是:ATRX表达的抑制导致36位赖氨酸位点的三甲基化修饰的组蛋白H3（H3K36me3）降低，而H3KPme3是毛细血管扩张性共济失调突变（ataxia telangiectasia mutated，ATM）信号通路的重要参与者，H3KPme3的减少降低了ATM的乙酰化，导致替莫唑胺诱导的ATM信号通路的激活受到抑制，而ATM信号通路又是重要的DNA修复机制，其抑制使DNA修复减少，替莫唑胺对细胞的杀伤效果增强；反之，ATRX基因表达的升高可以增强ATM信号通路的激活，导致替莫唑胺耐药的发生。

　　此外，有研究发现，生长阻滞和DNA损伤诱生蛋白45A（growth arrest and DNA damage inducible protein 45A，GADD45A）作为一种应激蛋白，在替莫唑胺作用于GBM时通过促进DNA的修复保护了GBM细胞，导致替莫唑胺耐药的形成；细胞暴露于基因毒性环境中时，GADD45A被激活，导致G2/M细胞周期检查点的执行，从而为DNA修复提供时间，活化的GADD45A通过与增殖细胞核抗原和脱嘌呤嘧啶核酸内切酶相互作用促进DNA的损伤修复，导致替莫唑胺耐药的发生，其具体机制可能与p53通路有关。